Capacidad de diferenciación de las células del Progenitor humano aórtica adiposo Perivascular gratis
Summary
El objetivo de este protocolo es para poner a prueba la capacidad de diferenciarse en múltiples linajes celulares de células progenitoras derivadas de tejido adiposo de humanos perivascular. Diferenciación fue comparada con las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea humana, que se conoce a diferenciarse en adipocitos, Osteocito y linajes de condrocitos.
Abstract
Tejido adiposo es una fuente rica de multi-potente células madre mesenquimales (MSC) capaces de diferenciarse en osteogénico, adipogenic y condrogénica. Adipogenic diferenciación de células progenitoras es un mecanismo importante de conducción disfunción y expansión del tejido adiposo en respuesta a la obesidad. Los cambios de comprensión en el tejido adiposo perivascular (PVAT) es clínicamente relevante en la enfermedad metabólica. Sin embargo, estudios previos han sido predominantemente en el ratón y otros animales modelos. Este protocolo utiliza humanos torácica PVAT las muestras recolectadas de pacientes sometidos a cirugía de bypass aortocoronario. Tejido adiposo de la aorta ascendente fue recogido y utilizado para la explantación de la fracción vascular estromal. Previamente confirmamos la presencia de células progenitoras adiposas en PVAT humano con capacidad de diferenciarse en que contiene lípidos adipocitos. En este estudio, se analizaron además el potencial de diferenciación de las células de la fracción vascular estromal, que presumiblemente contiene células progenitoras multi-potente. Comparamos las células PVAT derivadas de médula ósea humana MSC para la diferenciación en adipogenic, osteogénica y condrogénica linajes. Después de 14 días de diferenciación, las manchas específicas fueron utilizadas para detectar acumulación de lípidos en los adipocitos (O aceite rojo), depósitos calcíficos en células osteogénicos (alizarina rojo), o glicosaminoglicanos y colágeno en las células condrogénica (TRICROMICA de Masson). Mientras que la médula ósea MSC distingue eficientemente en los tres linajes, células derivadas del PVAT tenían adipogenic y condrogénica potencial, pero carecía de potencial osteogénico robusto.
Introduction
Tejido adiposo es una fuente rica de multi-potente células madre mesenquimales (MSC) capaces de diferenciarse en osteogénico, adipogenic y condrogénica linajes1. Este tejido se expande a través de la hipertrofia de los adipocitos maduros y de diferenciación de novo de MSC residente a adipocitos. El tejido adiposo perivascular (PVAT) rodea los vasos sanguíneos y regula la función vascular2,3. Expansión PVAT inducida por la obesidad exacerba la patología cardiovascular. Mientras que el potencial multipotent de MSC de depósitos adiposos subcutáneos humanos han sido bien estudiadas4,5, ningún estudio explantados y evaluó la capacidad de diferenciación de las células progenitoras PVAT derivado humano, probablemente debido a la invasividad de la contratación. Así, el objetivo de este trabajo es proporcionar una metodología de explantación y propagar células progenitoras de PVAT aórtica humana de pacientes con enfermedades cardiovasculares y para probar su propensión a diferenciar a osteogénico condrogénica y adipogenic linajes. Nuestra fuente de PVAT es desde el sitio de la anastomosis del injerto de bypass en el ascendente de la aorta de pacientes obesos sometidos a cirugía de bypass aortocoronario. PVAT recién aislado es enzimáticamente disociado y la fracción vascular estromal es aislada y propagada in vitro, lo que nos permite probar por primera vez la capacidad de diferenciación de células progenitoras derivadas de PVAT humana.
Usando primaria cultivados humanos PVAT stromal vascular fracción, probamos tres ensayos diseñados para inducir a las células madre/progenitoras para diferenciar hacia adipogenic, osteogénico, o linajes condrogénica. Nuestro estudio anterior identificó una población de CD73 +, CD105 + y células PDGFRa + (CD140a) que robusta pueden diferenciarse en adipocitos6, aunque no fue probado su multipotencia. PVAT directamente regula el tono y la inflamación vascular7. El fundamento para probar el potencial de diferenciación de esta población celular nuevo es comenzar a comprender la influencia especializada de PVAT sobre la función vascular y los mecanismos de expansión PVAT durante la obesidad. Esta metodología aumenta nuestra comprensión de las funciones de las células madre derivadas de tejido adiposo y nos permite identificar y comparar las similitudes y diferencias de las células progenitoras procedentes de diferentes tejidos. Se basan en enfoques establecidos y validados para aislar y diferenciar MSC hacia diversos linajes y optimizar procedimientos para maximizar la viabilidad de las células progenitoras derivadas PVAT humana. Estas técnicas tienen amplias aplicaciones en los campos del vástago y del progenitor investigación y tejido adiposo desarrollo de la célula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Células progenitoras adiposas de diferentes depósitos varían ampliamente en la diferenciación y el fenotipo potencial9. Cultivo de progenitores PVAT derivado de un solo donante paciente en inducción simultánea por tres linajes diferentes, adipogenic, osteogénica y condrogénica, permite una investigación bien controlada de la capacidad pluripotencial de esta novela población de células progenitoras. La metodología descrita en este informe se puede utilizar para probar la capacidad de di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos la ayuda de navegación de la investigación en el centro médico de Maine para ayudar con la obtención de tejido clínico, histopatología y núcleo de histomorfometría (apoyado por 1P20GM121301, L. Liaw PI) en el Maine Medical Center Research Instituto de corte y coloración. Este trabajo fue financiado por los NIH grant HL141149 R01 (Liaw L.).
Materials
| animal-free collagenase/dispase blend I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Aqueous solution pH 2.5 |
| Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
| Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
| antibiotic/antimycotic | ThermoFisher | 15240062 | |
| Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-glycerophosphate | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
| biotin | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Bouin's fixative | NewComerSupply | 1020A | |
| bovine serum albumin | Calbiochem | 12659 | stored at 4C |
| Cell detachment solution | Accutase | AT104 | |
| cell strainer (70mm) | Corning | 352350 | |
| dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 10565-042 | high glucose, glutamax, sodium bicarbinate |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| formalin | NewComerSupply | 1090 | |
| gelatin, bovine skin | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| glutamax | ThermoFisher | 35050061 | glutamine supplement |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| insulin solution | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| Oil red O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| pantothenic acid | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| penicillin-streptomycin solution | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| permount | Fisher | SP15-500 | |
| phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antimicrobial reagent for culture media. |
| rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Weigert's hematoxylin | EKI | 4880-100G |
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