ヒト大動脈血管周囲脂肪前駆細胞の分化能力
Summary
このプロトコルの目的は、複数の細胞系統に分化する人間の血管周囲脂肪組織由来幹細胞の能力をテストすることです。分化は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨に区別するために知られている人間の骨髄由来間葉系幹細胞と比較しました。
Abstract
脂肪組織が豊富な万能幹細胞 (MSC) に分化骨、脂肪細胞、軟骨細胞の血統。前駆細胞の脂肪細胞分化は、肥満に対する脂肪組織拡大と機能不全を運転する主要なメカニズムです。血管周囲脂肪組織 (PVAT) に変化を理解、代謝性疾患の臨床的に関連性の高いです。しかし、以前の研究は主にマウスや他の動物の実行をされているモデル。このプロトコルは、冠動脈バイパス手術を受けている患者から収集した人間の呼吸器 PVAT サンプルを使用します。上行大動脈からの脂肪組織は収集され、間質血管の端数の植用します。我々 は以前脂質含有に分化する能力を持つ人間 PVAT 脂肪前駆細胞の存在を確認した脂肪細胞。本研究では、おそらく万能幹細胞を含む間質血管分数からの細胞の微分の潜在性我々 さらに分析。ひと骨髄 MSC の脂肪、骨、軟骨細胞系統に分化する PVAT 由来細胞を比較しました。次の分化の 14 日は、特定の汚れ (オイル赤い O) 脂肪細胞における脂質の蓄積を検出を利用した骨形成系細胞 (アリザリン赤) やグリコサミノグリカンとコラーゲン軟骨幹細胞 (マッソンの Trichrome) の石灰鉱床。骨髄 MSC は効率的にすべての 3 つの系統に分化、PVAT 由来細胞が脂肪細胞と軟骨細胞の潜在的なしかし、骨の強い潜在性を欠けていた。
Introduction
脂肪組織が豊富な万能幹細胞 (MSC) に分化骨、脂肪細胞と軟骨細胞系統1。この組織は、成熟脂肪細胞の肥大と脂肪細胞に常駐の MSC の de novo 分化を通じて展開します。血管周囲脂肪組織 (PVAT) は血管を囲むし、血管機能2,3を調節します。PVAT 肥満膨張は、心血管系の病態を悪化させます。人間の皮下脂肪のデポから MSC の多能性の可能性はよく勉強4,5をされている、どんな研究が仔あり、ために可能性が高い人間 PVAT 由来神経前駆細胞の分化能力を評価調達の侵襲。したがって、この作業の目的は、外植体し、心血管疾患を持つ患者から人間の大動脈 PVAT から前駆細胞を伝播し、彼らに骨を区別する傾向、軟骨細胞、脂肪細胞系統をテストする方法を提供します。PVAT のわれわれの情報源は、肥満患者の冠動脈バイパス術後大動脈のバイパスの吻合部からです。離 PVAT は酵素によって解離と間質の血管の一部が分離され、in vitro で初めて人間 PVAT 由来神経前駆細胞の分化能力をテストする私たちを有効に伝達されます。
プライマリの培養ひと PVAT 間質血管分数を使用すると、脂肪細胞、骨、または軟骨系統の方向へ分化する幹細胞/前駆細胞を誘導するために設計された 3 つのアッセイをテストしました。私たちの以前の研究は、その率はテストしていませんが CD73 +、CD105 +、および脂肪細胞6に区別できる頑健 PDGFRa + (CD140a) 細胞の人口を識別されます。PVAT は直接血管の緊張や炎症の7を調整します。この細胞集団の微分の潜在性をテストするための理論的根拠は、専門 PVAT 血管機能に及ぼすと PVAT 拡張肥満のメカニズムを理解し始めるためです。この方法は脂肪組織の派生前駆細胞の機能の私達の理解を高めるおよび識別し、類似点と異なる組織由来の前駆細胞の違いを比較することが出来ます。我々 は確立され、検証されたアプローチを分離し、異なる系統へ MSC の差別化のために構築し、人間 PVAT 由来神経前駆細胞の生存率を最大化するための手順を最適化します。これらのテクニックは、幹・前駆細胞の研究と脂肪組織開発の分野で広範なアプリケーションを持っています。
Protocol
Representative Results
Discussion
別拠点から脂肪前駆細胞は、表現型と分化の潜在的な9が大きく異なります。3 つの異なる系統を同時誘導で単一の患者のドナーから PVAT 由来の前駆細胞を培養、脂肪細胞、骨、および軟骨、この小説の多能性容量の制御された調査可能します。前駆細胞の人口。人間 PVAT 由来の前駆細胞の分化能力をテストし、PVAT 病態と血管トーヌスの調節にその機能を理解する、このレ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は臨床組織・病理組織学的強度コア (1P20GM121301、l. 俊哉 PI がサポート) メイン医療研究センターの調達を支援するため研究ナビゲーション メイン メディカル センターでの支援を認める区分所染色.この作品は、NIH によって支えられた R01 HL141149 を付与 (L. 俊哉)。
Materials
| animal-free collagenase/dispase blend I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Aqueous solution pH 2.5 |
| Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
| Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
| antibiotic/antimycotic | ThermoFisher | 15240062 | |
| Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-glycerophosphate | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
| biotin | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Bouin's fixative | NewComerSupply | 1020A | |
| bovine serum albumin | Calbiochem | 12659 | stored at 4C |
| Cell detachment solution | Accutase | AT104 | |
| cell strainer (70mm) | Corning | 352350 | |
| dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 10565-042 | high glucose, glutamax, sodium bicarbinate |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| formalin | NewComerSupply | 1090 | |
| gelatin, bovine skin | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| glutamax | ThermoFisher | 35050061 | glutamine supplement |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| insulin solution | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| Oil red O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| pantothenic acid | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| penicillin-streptomycin solution | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| permount | Fisher | SP15-500 | |
| phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antimicrobial reagent for culture media. |
| rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Weigert's hematoxylin | EKI | 4880-100G |
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