मानव aortic परिसंवहनी एडिपोज जनक कोशिकाओं की भेदभाव क्षमता
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक से अधिक कोशिका वंशालयों में अंतर करने के लिए मानव परिसंवहनी वसा ऊतक से व्युत्पंन जनक कोशिकाओं की क्षमता का परीक्षण करने के लिए है । भेदभाव मध्योतक स्टेम मानव अस्थि मज्जा है, जो आदिपोसाइट, osteocyte, और chondrocyte वंश में अंतर करने के लिए जाना जाता है से व्युत्पंन कोशिकाओं की तुलना में था ।
Abstract
वसा ऊतक बहु-प्रबल मध्योतक स्टेम कोशिकाओं का एक समृद्ध स्रोत है (एमएससी) osteogenic में अंतर करने में सक्षम, adipogenic, और chondrogenic वंशाणुओं. जनक कोशिकाओं के एडिपोजेनिक भेदभाव मोटापे के जवाब में वसा ऊतक विस्तार और शिथिलता ड्राइविंग एक प्रमुख तंत्र है । परिसंवहनी वसा ऊतक (pvat) में परिवर्तन को समझना इस प्रकार नैदानिक चयापचय रोग में प्रासंगिक है । हालांकि, पिछले अध्ययन predominately किया गया है माउस और अंय पशु मॉडलों में प्रदर्शन किया । इस प्रोटोकॉल कोरोनरी धमनी बाईपास भ्रष्टाचार सर्जरी से गुजर रोगियों से एकत्र मानव वक्ष pvat नमूने का उपयोग करता है. आरोही महाधमनी से वसा ऊतक एकत्र किया गया था और स्ट्रोमल संवहनी अंश की explantation के लिए इस्तेमाल. हमने पहले मानव pvat में एडिपोज प्रोजेन्टर कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि की है ताकि लिपिड-युक्त एडिपोसाईट्स में अंतर करने की क्षमता हो । इस अध्ययन में, हम आगे स्ट्रोमल संवहनी अंश से कोशिकाओं के भेदभाव की क्षमता का विश्लेषण, संभवतः बहु शक्तिशाली जनक कोशिकाओं से युक्त. हम की तुलना में pvat-व्युत्पन्न कोशिकाओं को मानव अस्थि मज्जा एमएससी में भेदभाव के लिए एडिपोजेनिक, osteogenic, और chondrogenic वंशाणुओं. भेदभाव के 14 दिनों के बाद, विशिष्ट दाग adipocytes में लिपिड संचय का पता लगाने के लिए उपयोग किया गया (तेल लाल ओ), अस्थिजनक कोशिकाओं में calcific जमा (अलिज़रीन लाल), या glycosaminoglycans और chondrogenic कोशिकाओं में कोलेजन (masson trichrome). जबकि अस्थि मज्जा एमएससी कुशलतापूर्वक सभी तीन lineages में विभेदित, pvat व्युत्पंन कोशिकाओं adipogenic और chondrogenic क्षमता थी, लेकिन मजबूत osteogenic क्षमता का अभाव है ।
Introduction
वसा ऊतक बहु-प्रबल मध्योतक स्टेम कोशिकाओं का एक समृद्ध स्रोत है (एमएससी) osteogenic में फर्क करने में सक्षम, adipogenic, और chondrogenic वंश1. यह ऊतक परिपक्व adipocytes की अतिवृद्धि के माध्यम से फैलता है और निवासी एमएससी की डी नोवो भेदभाव adipocytes के लिए । परिसंवहनी वसा ऊतक (pvat) चारों ओर से घेरे रक्त वाहिकाओं और नियंत्रित करता है संवहनी समारोह2,3. मोटापा प्रेरित pvat विस्तार हृदय विकृतियों exacerbates. जबकि मानव चमड़े के नीचे आदिमुद्रा डिपो से एमएससी की multipotent क्षमता अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है4,5, कोई अध्ययन नहीं लगाया है और मानव pvat की भेदभाव क्षमता का मूल्यांकन-जनक कोशिकाओं व्युत्पंन, की संभावना के कारण खरीद की असावधानी । इस प्रकार, इस काम के लक्ष्य के लिए एक कार्यप्रणाली की पड़ताल और मानव महाधमनी pvat से हृदय रोग के साथ रोगियों से प्रोजेन्टर कोशिकाओं का प्रचार करने के लिए और उनके osteogenic को अंतर करने की प्रवृत्ति का परीक्षण करने के लिए है, chondrogenic, और adipogenic वंश. pvat का हमारा स्रोत कोरोनरी धमनी बाईपास भ्रष्टाचार सर्जरी से गुजर मोटापे से ग्रस्त रोगियों की महाधमनी आरोही पर बाईपास भ्रष्टाचार के सम्मिलन की साइट से है । हौसले से अलग pvat enzymatically-dissociated है और स्ट्रोमल संवहनी अंश अलग है और विट्रो में प्रचारित, हमें सक्षम करने के लिए पहली बार मानव pvat-व्युत्पन्न जनक कोशिकाओं की भेदभाव क्षमता का परीक्षण करने के लिए.
प्राथमिक संवर्धित मानव pvat स्ट्रोमल संवहनी अंश का उपयोग करना, हम स्टेम को प्रेरित करने के लिए बनाया गया तीन assays का परीक्षण/प्रोजेन्टर कोशिकाओं को एडिपोजेनिक, ऑस्टियोजेनिक, या chondrogenic वंश की ओर अंतर करने के लिए. हमारे पूर्व अध्ययन CD73 की आबादी की पहचान की +, CD105 +, और pdgfra + (CD140a) कोशिकाओं है कि robustly6adipocytes में अंतर कर सकते हैं, हालांकि उनकी बहुशक्ति का परीक्षण नहीं किया गया. pvat सीधे संवहनी टोन और सूजन को नियंत्रित करता है7. इस उपन्यास सेल जनसंख्या के भेदभाव क्षमता के परीक्षण के लिए तर्क संवहनी समारोह पर pvat के विशेष प्रभाव को समझने के लिए शुरू करने के लिए है, और मोटापे के दौरान pvat विस्तार के तंत्र. इस पद्धति में वसा ऊतक व्युत्पन्न के कार्यों की हमारी समझ को बढ़ाता है और हमें विभिन्न ऊतक स्रोतों से समानता और संतति कोशिकाओं के मतभेदों की पहचान करने और तुलना करने में सक्षम बनाता है । हम अलग और विभिंन वंश की ओर एमएससी फर्क और प्रक्रियाओं का अनुकूलन करने के लिए मानव pvat की व्यवहार्यता को अधिकतम करने के लिए स्थापित और सत्यापित दृष्टिकोण पर निर्माण-जनक कोशिकाओं व्युत्पंन । इन तकनीकों स्टेम और जनक सेल अनुसंधान और वसा ऊतक विकास के क्षेत्रों में व्यापक आवेदन किया है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
विभिन्न डिपो से आडिपोज जनक कोशिकाओं phenotype और भिंनता संभावित9में व्यापक रूप से बदलती हैं । culturing pvat-एक एकल रोगी दाता से व्युत्पंन progenitors एक साथ तीन अलग वंश, adipogenic, osteogenic, और chondrogenic नीचे प्रेरण में, इस उपंयास की…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम नैदानिक ऊतक की खरीद के साथ सहायता करने के लिए मेन मेडिकल सेंटर में अनुसंधान नेविगेशन की सहायता स्वीकार करते हैं, और मुख्य चिकित्सा केंद्र अनुसंधान में (1p20gm121301, एल liaw पीआई द्वारा समर्थित) हिस्टोथोलॉजी और histopathology कोर संस्थान को सेक्शनिंग और धुंधला करने के लिए । इस काम nih अनुदान R01 HL141149 (एल liaw) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| animal-free collagenase/dispase blend I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Aqueous solution pH 2.5 |
| Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
| Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
| antibiotic/antimycotic | ThermoFisher | 15240062 | |
| Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-glycerophosphate | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
| biotin | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Bouin's fixative | NewComerSupply | 1020A | |
| bovine serum albumin | Calbiochem | 12659 | stored at 4C |
| Cell detachment solution | Accutase | AT104 | |
| cell strainer (70mm) | Corning | 352350 | |
| dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 10565-042 | high glucose, glutamax, sodium bicarbinate |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| formalin | NewComerSupply | 1090 | |
| gelatin, bovine skin | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| glutamax | ThermoFisher | 35050061 | glutamine supplement |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| insulin solution | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| Oil red O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| pantothenic acid | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| penicillin-streptomycin solution | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| permount | Fisher | SP15-500 | |
| phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antimicrobial reagent for culture media. |
| rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Weigert's hematoxylin | EKI | 4880-100G |
References
- Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).
- Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. Differentiation of adipose stem cells. Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Boucher, J. M., et al. Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
- Nosalski, R., Guzik, T. J. Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).
- Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).
- Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells. Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).
- de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related. Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).
- Majesky, M. W. Adventitia and perivascular cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).
- Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. Adipose tissue stem cells in regenerative medicine. Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).
- Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
- Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine. Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Safford, K. M., et al. Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).
- Ashjian, P. H., et al. In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).
- Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes. Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
