Un modello di cancro endometriale ortotopico con retroperitoneale Lmphadenopatia fatta da cellule VX2 in vivo propagate e coltivate

Summary

Questo protocollo presenta un metodo standardizzato per far crescere le cellule VX2 in coltura e per creare un modello ortotopico VX2 di cancro endometriale con metastasi di linfonodi retroperitoneali nei conigli. I modelli di cancro endometriali ortotopici sono importanti per lo studio preclinico di nuove modalità di imaging per la diagnosi delle metastasi dei linfonodi.

Abstract

Il cancro dell’endometrio è la malignità ginecologica più comune in Nord America e l’incidenza è in aumento in tutto il mondo. Il trattamento consiste in un intervento chirurgico con o senza terapia adiuvante a seconda del coinvolgimento del linfonodo determinato dalla linfadenectomia. La linfodenectomia è una procedura morbosa, che non è stata dimostrata avere un beneficio terapeutico in molti pazienti, e quindi è necessario un nuovo metodo per diagnosticare le metastasi dei linfonodi. Per testare nuovi agenti di imaging, è necessario un modello affidabile di cancro endometriale con metastasi di linfonodi retroperitoneali. Il modello di cancro endometriale VX2 è stato descritto frequentemente nella letteratura; tuttavia, esiste una variazione significativa rispetto al metodo di stabilimento del modello. Inoltre, non sono stati riportati studi sull’uso di cellule VX2 coltivate per creare questo modello in quanto solo le cellule propagate in vivo sono state utilizzate in precedenza. Qui, vi presentiamo un metodo chirurgico standardizzato e un metodo di monitoraggio post-operatorio per la creazione del modello di cancro endometriale VX2 e riferiamo sul primo utilizzo di cellule VX2 coltivate per creare questo modello.

Introduction

Il cancro dell’endometrio, o cancro del rivestimento dell’utero, è la seconda malignità ginecologica più comune al mondo e la malignità più comune nelle nazioni sviluppate¹. L’incidenza del cancro endometriale è aumentata costantemente, aumentando del 2,3% all’anno tra il 2005 e il 2013 con un corrispondente aumento del 2,2% della mortalità^1,2^,3. La diagnosi delle metastasi dei linfonodi è fondamentale in quanto la presenza di linfonodi positivi è un forte predittore negativo di sopravvivenza^4,5,6,7 e può guidare la somministrazione di terapia adiuvante^{8,9,10,11,12,13}. Le metastasi dei linfonodi sono attualmente diagnosticate rimuovendo chirurgicamente il tessuto linfatico sovrastante i principali vasi sanguigni del bacino e dell’addome. Questa procedura, nota come linfodenectomia, è controversa a causa di dati di sopravvivenza contrastanti da due grandi prove^{14,15,16,17,18} e il noto rischio di^15,19,20 e morbilità post-operatoria^21,22,23. Poiché le attuali modalità di imaging non invasivo non hanno la sensibilità e la specificità necessarie per sostituire la dissezione^{n. 24}dei linfonodi, c’è stata una spinta a sviluppare nuove tecniche di imaging diagnostico. Per testare queste nuove tecniche in un ambiente preclinico, è necessario un modello affidabile di cancro endometriale con metastasi di linfonodi retroperitoneali.

Il coniglio VX2 modello tumorale è un modello ben consolidato che è stato ampiamente utilizzato per studiare più tumori dell’organo solido umano²⁵ tra cui polmone²⁶, testa e collo^27,28, fegato²⁹, rene³⁰, osso^31,32, cervello³³, pancreas³⁴ e utero^35,36,37. Il modello VX2 è stato originariamente sviluppato nel 1940 da Kidd e Rous³⁸ trapiantando con successo un papilloma di coniglio di cotone scoperto da Shope nel 1933³⁹. Da quel momento, il modello VX2 è stato mantenuto in vivo, richiedendo il passaggio seriale nel muscolo quadricipite dei conigli bianchi della Nuova èelanda⁴⁰. Più recentemente, tuttavia, più gruppi sono cresciuti con successo cellule VX2 in vitro^40,41,42 e dimostrato la tumorigeneità mantenuta della linea cellulare coltivata^{31, 42,43}. I tumori VX2 sono istologicamente definiti come carcinomi a cellule squamose anaplastiche⁴⁴ e contengono caratteristiche ghiandolari che assomigliano adenocarcinoma²⁶. I tumori sono caratterizzati da facilità di impianto, rapida crescita e ipervascolarizzazione^44,45 e metastatizza in modo affidabile, più comunemente ai linfonodi regionali e distanti⁴⁵. Le somiglianze nell’anatomia vascolare e linfatica uterina⁴⁶ così come il sito di crescita ortotopica assicurano che il modello metastatico del coniglio VX2 carcinoma mimi quello del cancro endometriale umano, rendendo il modello VX2 un modello affidabile per lo studio umano malattia metastatica. Inoltre, caratteristiche istologiche come la proliferazione microvascolare anormale⁴⁷ , così come immunologiche⁴⁸ e somiglianze genetiche^49,50 tra gli esseri umani e i conigli suggeriscono che il tumore microambiente può riflettere quello del cancro dell’endometrio umano.

Più gruppi hanno riferito sull’uso di VX2 per creare un modello di cancro endometriale con metastasi retroperitoneali con un alto tasso riportato di successo^36,51,52; tuttavia, esiste una variazione significativa all’interno della letteratura attuale rispetto al metodo di creazione del modello. Dosi di sospensione cellulare a partire da 4 x 10⁵ cellule / corno uterino⁵¹ e fino a 5 x 10⁹ cellule / corno uterino^37,53 sono stati segnalati con nessun consenso standard sulla dose cellulare VX2 richiesta. Inoltre, una varietà di metodi di inoculazione sono stati segnalati tra cui l’impianto micro-chirurgico del tumore nel miometrio uterino³⁶, iniezione di sospensione cellulare VX2^{37,44,52 , 53} e in alcuni casi, l’aggiunta di corno uterino sutura prima dell’innoculazione⁵². Infine, nessun gruppo ha segnalato l’uso di cellule VX2 coltivate per creare questo modello. Pertanto, lo scopo di questo studio è quello di dimostrare un metodo standardizzato di successo di creazione del modello VX2 e di segnalare il primo utilizzo di cellule VX2 coltivate per creare un modello di cancro endometriale con metastasi retroperitoneali in un coniglio.

Protocol

Chiusura profonda della parete addominale: Identificare l’apice dell’incisione peritoneale e afferrare il peritoneo, il muscolo retto e la forza del tessuto della fascia. Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti nelle strutture approvate dall’Animal Resource Center (ARC) dell’University Health Network e in conformità con i protocolli approvati per l’uso e la cura degli animali (AUP #3994/#4299). La linea cellulare VX2 è stata ottenuta dal Dr. Aken’s Lab presso l’University Health Network. <p class="jove_ti…

Representative Results

Ventotto conigli sono stati utilizzati per la creazione del modello di cancro dell’endometriale. I conigli avevano un peso medio di 2,83 kg (2,71-3,58 kg) al momento dell’esperimento. I tumori uterini sono cresciuti con successo in 21 conigli per un tasso di successo generale del modello del 75%. Prima dell’inclusione della sutura uterina nel protocollo, il tasso di successo era del 57% rispetto all’81% dopo l’aggiunta della sutura uterina. La sutura uterina è stata aggiunta al protocoll…

Discussion

Qui, abbiamo segnalato un metodo chirurgico standardizzato per la creazione di un modello di cancro dell’endometrio VX2 e riportato sul primo uso di cellule VX2 coltivate per creare questo modello. Il tumore prendere tasso di 75% è inferiore al 100% percentuale tasso precedentemente riportato nella letteratura^35,37,53,56; tuttavia, il tasso del 90% di metastasi di linfonodi patologicamente con…

Materials

11-blade scalpel, Sterile, Disposible	Aspen Surgical (VWR)	80094-086
22-gague ear vein catheter	CDMV	14332
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb)	Covidien	356718
3-0 braided absorbable suture (Polysorb)	Covidien	356718
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon	Falcon	352350
Acepromazine (Atravet)	CDMV	1047
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%)	CDMV	4363
Betadine solution (Poviodone iodine 10%)	UHN Stores	457955
Buprenorphine	McGill University
Cefazolin	UHN in-patient pharmacy	No Cat # Needed
Chlorhexidine solution	CDMV	119872
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes	Corning	354450	brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates	Corning	354408	brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates	Corning	354400	brand not important
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL	Corning	354234
DMEM/HAM F12 1:1	Life Technologies	11320	brand not important
DMSO	Caledon Lab Chem	1/10/4100
Enrofloxacin (Baytril injectable)	CDMV	11242
Falcon Tube	Corning Centri-Star	430828
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml	Life Technologies	12483020	brand/source not important
Isoflurane	UHN in-patient pharmacy	No Cat # Needed
Isohexol contrast	GE Healthcare	407141210
Meloxicam (Metacam 0.5%)	CDMV	104674
Normal Saline	House Brand (UofT Medstore)	1011
PBS	Multicell or Sigma	331-010-CL or D8537-500mL
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin)	Corning-Cellgro	CA45000-652
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)	T.C.M.F (Dr Bristow)	28-Jan-11
Surgical Glue (Tissue Adhesive)	3M Vetbond	14695B
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade	Sigma	T-6567-5X20UG
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml	Wisent Inc	325-542-EL	brand not important