Um modelo de câncer endometrial ortotópico com linfadenopatia retroperitoneal feita a partir de in vivo propagadas e cultivadas VX2 células

Summary

Este protocolo apresenta um método estandardizado para crescer VX2 pilhas na cultura e para criar um modelo VX2 transplantação orthotopic do do cancro endometrial com metástases de nó de linfa retroperitoneal nos coelhos. Os modelos do cancro endometrial de orthotopic são importantes para o estudo pré-clínico de modalidades novas da imagem latente para o diagnóstico de metástases de nó de linfa.

Abstract

O cancro endometrial é a malignidade gynecologic a mais comum em America do Norte e a incidência está levantando-se no mundo inteiro. O tratamento consiste em cirurgia com ou sem terapia adjuvante, dependendo da participação do linfonodo, conforme determinado pela linfadenectomia. Lymphadenectomy é um procedimento mórbido, que não seja mostrado para ter um benefício terapêutico em muitos pacientes, e assim um método novo para diagnosticar metástases de nó de linfa é exigido. Para testar os agentes novos da imagem latente, um modelo de confiança do cancro endometrial com metástases de nó de linfa retroperitoneal é necessário. O modelo VX2 do cancro endometrial foi descrito freqüentemente na literatura; no entanto, existe uma variação significativa no que diz respeito ao método de estabelecimento de modelo. Além disso, nenhum estudo relatou sobre o uso de células VX2 cultivadas para criar esse modelo, pois apenas as células propagadas in vivo têm sido utilizadas anteriormente. Neste estudo, apresentamos um método cirúrgico padronizado e um método de monitorização pós-operatória para o estabelecimento do modelo de câncer endometrial VX2 e relato do primeiro uso de células VX2 cultivadas para criar esse modelo.

Introduction

O cancro endometrial, ou o cancro do forro do útero, são a segunda malignidade gynecologic a mais comum no mundo inteiro e a malignidade a mais comum em nações desenvolvidas¹. A incidência de câncer de endométrio tem aumentado constantemente, elevando-se em 2,3% ao ano entre 2005-2013 com um aumento correspondente de 2,2% na mortalidade^1,2,3. O diagnóstico das metástases linfonodais é primordial, pois a presença de linfonodos positivos é um forte preditor negativo desobrevida^4,5,6,7e pode orientar a administração de terapia adjuvante^{8,9,10,11,12,13}. As metástases de nó de linfa são diagnosticadas cirurgicamente removendo o tecido linfático que sobrejacente os vasos sanguíneos principais na pelve e no abdômen. Este procedimento, conhecido como lymphadenectomy, é controverso devido aos dados conflitantes da sobrevivência de dois testes grandes^{14,15,16,17,18} e o conhecido risco de^15,19,20 e morbidade pós-operatória^21,22,23. Como as modalidades não invasoras atuais da imagem latente não têm a sensibilidade e a especificidade exigidas para substituir a dissecção do nó de linfa²⁴, houve um impulso para desenvolver técnicas diagnósticas novas da imagem latente. Para testar estas técnicas novas em um ajuste pre-Clinical, um modelo de confiança do cancro endometrial com metástases de nó de linfa retroperitoneal é exigido.

O modelo do tumor do coelho VX2 é um modelo bem estabelecido que seja usado extensivamente para estudar tumores contínuos humanos múltiplos do órgão²⁵ que incluem o pulmão²⁶, a cabeça e a garganta^27,28, fígado²⁹, rim³⁰, osso^31,32, cérebro³³, pâncreas³⁴ e útero^35,36,37. O modelo VX2 foi originalmente desenvolvido em 1940 por Kidd e Rous³⁸ ao transplantar com sucesso um vírus de papiloma de coelho de algodão descoberto por Shope em 1933³⁹. Desde aquela época, o modelo VX2 foi mantido in vivo, exigindo passagem serial no músculo quadríceps de coelhos brancos da Nova Zelândia⁴⁰. Mais recentemente entretanto, os grupos múltiplos cresceram com sucesso VX2 pilhas in vitro^40,41,42 e demonstraram o tumorigenecity retido da linha de pilha cultivada^{31, 42,43}. Os tumores VX2 são definidos histològica como carcinomas de pilha Squamous Anaplastic⁴⁴ e contêm as características glandular que se assemelham ao adenocarcinoma²⁶. Os tumores são caracterizados pela facilidade da implantação, pelo crescimento rápido e pelo Hyper-vascularity^44,pelo⁴⁵ e por metastasize confiantemente, o mais geralmente aos nós de linfa regionais e distantes⁴⁵. Similaridades na anatomia vascular e linfática uterine⁴⁶ assim como o local transplantação orthotopic do do crescimento asseguram-se de que o teste padrão metastático da carcinoma VX2 do coelho imita aquele do cancro endometrial humano, fazendo ao modelo VX2 um modelo de confiança para estudar o ser humano doença metastática. Além disso, as características histologic tais como a proliferação microvascular anormal⁴⁷ , assim como⁴⁸ imunológicos e similaridades genéticas^49,50 entre seres humanos e coelhos sugerem que o tumor microambiente pode refletir o de câncer de endométrio humano.

Os grupos múltiplos relataram no uso de VX2 para criar um modelo do cancro endometrial com metástases retroperitoneal com uma taxa relatada elevada do sucesso^36,51,52; no entanto, existe uma variação significativa na literatura atual com respeito ao método de criação do modelo. As doses da suspensão da pilha tão baixas quanto 4 x 10⁵ pilhas/chifre uterine⁵¹ e tão altamente quanto 5 x 10⁹ pilhas/chifre uterine^37,53 foram relatados sem o consenso padrão na dose celular exigida VX2. Também, uma variedade de métodos da inoculação foi relatada que inclui a implantação microcirúrgica do tumor no miométrio uterine³⁶, injeção da suspensão VX2 da pilha^{37,44,52 , 53} e, em alguns casos, a adição de chifre uterino suturando antes da inoculação⁵². Finalmente, nenhum grupo relatou o uso de células VX2 cultivadas para criar esse modelo. Assim, a finalidade deste estudo é demonstrar um método padronizado bem sucedido da criação do modelo VX2 e relatar o primeiro uso de pilhas VX2 cultivadas para criar um modelo do cancro endometrial com metástases retroperitoneal em um coelho.

Protocol

Fechamento da parede abdominal profunda: identifique o ápice da incisão peritoneal e segure o peritônio, músculo reto e fáscia com fórceps tecidual. Todos os estudos em animais foram conduzidos em instalações aprovadas pelo centro de recursos animais (ARC) da rede de saúde universitária e de acordo com os protocolos de uso e cuidado de animais aprovados (AUP #3994/#4299). A linha celular VX2 foi obtida do laboratório do Dr. Aken na rede de saúde da Universidade. 1. criação de linha…

Representative Results

Vinte e oito coelhos foram utilizados para a criação do modelo de câncer endometrial. Os coelhos apresentaram um peso médio de 2,83 kg (2,71-40, 5kg) no momento do experimento. Os tumores uterine cresceram com sucesso em 21 coelhos para uma taxa de sucesso total do modelo de 75%. Antes da inclusão da sutura uterina no protocolo, a taxa de sucesso foi de 57% em relação a 81% após a sutura uterina ser adicionada. A sutura uterina foi adicionada ao protocolo após o 7º co…

Discussion

Nisto, nós relatamos um método cirúrgico estandardizado para o estabelecimento de um modelo endometrial do cancro de VX2 e relatado no primeiro uso de pilhas VX2 cultivadas para criar este modelo. O tumor toma a taxa de 75% é mais baixo do que a taxa de 100% por cento relatada previamente na literatura^35,37,53,56; Entretanto, a taxa de THW 90% de metástases de nó de linfa patològica conf…

Materials

11-blade scalpel, Sterile, Disposible	Aspen Surgical (VWR)	80094-086
22-gague ear vein catheter	CDMV	14332
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb)	Covidien	356718
3-0 braided absorbable suture (Polysorb)	Covidien	356718
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon	Falcon	352350
Acepromazine (Atravet)	CDMV	1047
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%)	CDMV	4363
Betadine solution (Poviodone iodine 10%)	UHN Stores	457955
Buprenorphine	McGill University
Cefazolin	UHN in-patient pharmacy	No Cat # Needed
Chlorhexidine solution	CDMV	119872
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes	Corning	354450	brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates	Corning	354408	brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates	Corning	354400	brand not important
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL	Corning	354234
DMEM/HAM F12 1:1	Life Technologies	11320	brand not important
DMSO	Caledon Lab Chem	1/10/4100
Enrofloxacin (Baytril injectable)	CDMV	11242
Falcon Tube	Corning Centri-Star	430828
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml	Life Technologies	12483020	brand/source not important
Isoflurane	UHN in-patient pharmacy	No Cat # Needed
Isohexol contrast	GE Healthcare	407141210
Meloxicam (Metacam 0.5%)	CDMV	104674
Normal Saline	House Brand (UofT Medstore)	1011
PBS	Multicell or Sigma	331-010-CL or D8537-500mL
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin)	Corning-Cellgro	CA45000-652
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)	T.C.M.F (Dr Bristow)	28-Jan-11
Surgical Glue (Tissue Adhesive)	3M Vetbond	14695B
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade	Sigma	T-6567-5X20UG
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml	Wisent Inc	325-542-EL	brand not important