Un modelo de cáncer de endometrio ortotópico con linfadenopatía retroperitoneal hecha de células VX2 cultivadas y cultivadas en Vivo

Summary

Este protocolo presenta un método estandarizado para cultivar células VX2 en cultivo y para crear un modelo ortotópico VX2 de cáncer endometrial con metástasis de ganglios linfáticos retroperitoneales en conejos. Los modelos de cáncer de endometrio ortotópico son importantes para el estudio preclínico de nuevas modalidades de diagnóstico por imágenes para el diagnóstico de metástasis de ganglios linfáticos.

Abstract

El cáncer de endometrio es la neoplasia maligna ginecológica más común en América del Norte y la incidencia está aumentando en todo el mundo. El tratamiento consiste en cirugía con o sin tratamiento adyuvante dependiendo de la afectación de los ganglios linfáticos según lo determinado por la linfadenectomía. La linfadenectomía es un procedimiento mórbido, que no ha demostrado tener un beneficio terapéutico en muchos pacientes, por lo que se requiere un nuevo método para diagnosticar metástasis de ganglios linfáticos. Para probar nuevos agentes de imágenes, se necesita un modelo fiable de cáncer endometrial con metástasis de ganglios linfáticos retroperitoneales. El modelo de cáncer de endometrio VX2 se ha descrito con frecuencia en la literatura; sin embargo, existe una variación significativa con respecto al método de establecimiento de modelos. Además, no se han reportado estudios sobre el uso de células VX2 cultivadas para crear este modelo, ya que sólo las células propagadas in vivo se han utilizado previamente. En este documento, presentamos un método quirúrgico estandarizado y un método de monitoreo postoperatorio para el establecimiento del modelo de cáncer de endometrio VX2 e informamos sobre el primer uso de células VX2 cultivadas para crear este modelo.

Introduction

El cáncer de endometrio, o cáncer del revestimiento del útero, es la segunda neoplasia maligna ginecológica más común a nivel mundial y la neoplasia maligna más común en las naciones desarrolladas¹. La incidencia de cáncer de endometrio ha aumentado constantemente, aumentando un 2,3% anual entre 2005-2013, con un correspondiente aumento del 2,2% en la mortalidad^1,2,3. El diagnóstico de metástasis de ganglios linfáticos es primordial ya que la presencia de ganglios linfáticos positivos es un fuerte predictor negativo de supervivencia^4,5,6,7 y puede guiar la administración de terapia adyuvante^{8,9,10,11,12,13}. Actualmente, las metástasis de los ganglios linfáticos se diagnostican mediante la extirpación quirúrgica del tejido linfático que cubre los vasos sanguíneos principales de la pelvis y el abdomen. Este procedimiento, conocido como linfadenectomía, es controvertido debido a los datos de supervivencia contradictorios de dos grandes ensayos^{14,15,16,17,18} y los conocidos riesgo intraoperatorio^15,19,20 y morbilidad postoperatoria^21,22,23. Dado que las modalidades de imagen no invasivas actuales no tienen la sensibilidad y especificidad necesarias para reemplazar la disección²⁴de los ganglios linfáticos, se ha producido un impulso para desarrollar nuevas técnicas de diagnóstico por imágenes. Para probar estas nuevas técnicas en un entorno preclínico, se requiere un modelo fiable de cáncer de endometrio con metástasis de ganglios linfáticos retroperitoneales.

El modelo tumoral de conejo VX2 es un modelo bien establecido que se ha utilizado ampliamente para estudiar múltiples tumores de órganos sólidos humanos²⁵ incluyendo pulmón^26,cabeza y cuello^27,28, hígado²⁹, riñón³⁰, hueso^31,32, cerebro³³, páncreas³⁴ y útero^35,36,37. El modelo VX2 fue desarrollado originalmente en 1940 por Kidd y Rous³⁸ trasplantando con éxito un virus del papiloma de conejo de cola de algodón descubierto por Shope en 1933^39. Desde entonces, el modelo VX2 se ha mantenido in vivo, requiriendo paso en serie en el músculo cuádriceps de conejos blancos de Nueva Zelanda^40. Más recientemente, sin embargo, múltiples grupos han cultivado con éxito células VX2 in vitro^40,41,42 y demostrado la tumorigeneidad retenida de la línea celular cultivada^{31, 42,43}. Los tumores VX2 se definen histológicamente como carcinomas de células escamosas anaplásicas⁴⁴ y contienen rasgos glandulares que se asemejan al adenocarcinoma^26. Los tumores se caracterizan por la facilidad de implantación, crecimiento rápido e hipervascularización^44,45 y metástasis fiable, más comúnmente a los ganglios linfáticos regionales y distantes^45. Las similitudes en la anatomía uterina vascular y linfática^46, así como en el sitio de crecimiento ortotópico aseguran que el patrón metastásico del carcinoma VX2 del conejo imita al del cáncer de endometrio humano, haciendo del modelo VX2 un modelo fiable para el estudio humano enfermedad metastásica. Además, características histológicas como la proliferación microvascular anormal^47, así como las similitudes inmunológicas⁴⁸ y genéticas^49,50 entre humanos y conejos sugieren que el tumor microambiente puede reflejar el del cáncer de endometrio humano.

Múltiples grupos han informado sobre el uso de VX2 para crear un modelo de cáncer de endometrio con metástasis retroperitoneales con una alta tasa de éxito reportado^36,51,52; sin embargo, existe una variación significativa dentro de la literatura actual con respecto al método de creación de modelos. Dosis de suspensión celular tan bajas como 4 x 10⁵ células/cuerno uterino⁵¹ y tan altas como 5 x 10⁹ células/cuerno uterino^37,53 se han reportado sin consenso estándar sobre la dosis celular VX2 requerida. También, una variedad de métodos de inoculación se han divulgado incluyendo la implantación microquirúrgica del tumor en el miometrio uterino³⁶, inyección de suspensión celular VX2^{37,44,52 , 53} y en algunos casos, la adición de cuerno uterino suturando antes de la innoculación⁵². Por último, ningún grupo ha informado del uso de celdas VX2 cultivadas para crear este modelo. Por lo tanto, el propósito de este estudio es demostrar un método estandarizado exitoso de creación de modelos VX2 e informar del primer uso de células VX2 cultivadas para crear un modelo de cáncer endometrial con metástasis retroperitoneales en un conejo.

Protocol

Cierre profundo de la pared abdominal: Identificar el ápice de la incisión peritoneal y agarrar el peritoneo, el músculo rectus y la fascia con fórceps tisulares. Todos los estudios en animales se llevaron a cabo en las instalaciones aprobadas por el Centro de Recursos Animales (ARC) de la Red Universitaria de Salud y de acuerdo con los protocolos aprobados de uso y cuidado de animales (AUP #3994/#4299). La línea celular VX2 se obtuvo del Laboratorio del Dr. Aken en la Red de Salud de la Universidad. <p class="j…

Representative Results

Veintiocho conejos fueron utilizados para la creación del modelo de cáncer de endometrio. Los conejos tenían un peso promedio de 2,83 kg (2,71-3,58 kg) en el momento del experimento. Los tumores uterinos crecieron con éxito en 21 conejos para una tasa general de éxito del modelo del 75%. Antes de la inclusión de la sutura uterina en el protocolo, la tasa de éxito fue del 57% en comparación con el 81% después de que se añadiera la sutura uterina. Sutura uterina se añadió al pro…

Discussion

En este documento, hemos informado de un método quirúrgico estandarizado para el establecimiento de un modelo de cáncer de endometrio VX2 y reportado sobre el primer uso de células VX2 cultivadas para crear este modelo. La tasa de toma de tumores del 75% es inferior a la tasa del 100% reportada anteriormente en la literatura^35,37,53,56; sin embargo, la tasa del 90% de metástasis de ganglio…

Materials

11-blade scalpel, Sterile, Disposible	Aspen Surgical (VWR)	80094-086
22-gague ear vein catheter	CDMV	14332
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb)	Covidien	356718
3-0 braided absorbable suture (Polysorb)	Covidien	356718
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon	Falcon	352350
Acepromazine (Atravet)	CDMV	1047
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%)	CDMV	4363
Betadine solution (Poviodone iodine 10%)	UHN Stores	457955
Buprenorphine	McGill University
Cefazolin	UHN in-patient pharmacy	No Cat # Needed
Chlorhexidine solution	CDMV	119872
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes	Corning	354450	brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates	Corning	354408	brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates	Corning	354400	brand not important
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL	Corning	354234
DMEM/HAM F12 1:1	Life Technologies	11320	brand not important
DMSO	Caledon Lab Chem	1/10/4100
Enrofloxacin (Baytril injectable)	CDMV	11242
Falcon Tube	Corning Centri-Star	430828
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml	Life Technologies	12483020	brand/source not important
Isoflurane	UHN in-patient pharmacy	No Cat # Needed
Isohexol contrast	GE Healthcare	407141210
Meloxicam (Metacam 0.5%)	CDMV	104674
Normal Saline	House Brand (UofT Medstore)	1011
PBS	Multicell or Sigma	331-010-CL or D8537-500mL
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin)	Corning-Cellgro	CA45000-652
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)	T.C.M.F (Dr Bristow)	28-Jan-11
Surgical Glue (Tissue Adhesive)	3M Vetbond	14695B
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade	Sigma	T-6567-5X20UG
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml	Wisent Inc	325-542-EL	brand not important