Ортотопические эндометрия рака модель с ретроперитонеальной лимфаденопатии Сделано из In Vivo распространяется и культивированных VX2 клеток

Summary

Этот протокол представляет собой стандартизированный метод для выращивания клеток VX2 в культуре и создания ортотопической модели VX2 рака эндометрия с ретроперитонеальными лимфатическими метастазами у кроликов. Ортотопические модели рака эндометрия имеют важное значение для доклинического исследования новых методов визуализации для диагностики метастаз лимфатических узлов.

Abstract

Рак эндометрия является наиболее распространенным гинекологических злокачественных новообразований в Северной Америке и заболеваемость растет во всем мире. Лечение состоит из хирургии с или без адъювантной терапии в зависимости от участия лимфатических узлов, как это определено лимфаденэктомии. Лимфаденэктомия является болезненной процедурой, которая не была показана, чтобы иметь терапевтическую пользу у многих пациентов, и, таким образом, новый метод диагностики метастазов лимфатических узлов не требуется. Для тестирования новых агентов визуализации необходима надежная модель рака эндометрия с ретроперитонеальными метастазами лимфатических узлов. Модель рака эндометрия VX2 часто описывается в литературе; однако существуют значительные различия в отношении метода создания моделей. Кроме того, никаких исследований не сообщалось об использовании культивированных клеток VX2 для создания этой модели, поскольку только клетки, распространяемые in vivo, ранее использовались. В этом виде мы представляем стандартизированный хирургический метод и метод послеоперационного мониторинга для создания модели рака эндометрия VX2 и сообщаем о первом использовании культивированных клеток VX2 для создания этой модели.

Introduction

Рак эндометрия, или рак слизистой оболочки матки, является вторым наиболее распространенным гинекологических злокачественных новообразований во всем мире и наиболее распространенных злокачественных новообразований в развитых странах¹. Заболеваемость раком эндометрия неуклонно растет, увеличившись на 2,3% в год в период 2005-2013 годов с соответствующим 2,2% увеличение смертности^1,2,3. Диагноз метастазах лимфатических узлов имеет первостепенное значение, так как наличие положительных лимфатических узлов является сильным отрицательным предиктором выживания^4,5,6,7 и может направлять администрирование адъювантная терапия^{8,9,10,11,12,13}. Метастазовые лимфатические узлы в настоящее время диагностируются хирургическим путем удаления лимфатических тканей, лежащих в основных кровеносных сосудов в тазе и животе. Эта процедура, известная как лимфаденэктомия, является спорным из-за противоречивых данных выживания из двух больших испытаний^{14,15,16,17,18} и известных риск внутриоперационной^15,19,20 и послеоперационной заболеваемости^21,22,23. Поскольку современные неинвазивные методы визуализации не обладают необходимой чувствительностью и специфичностью для замены рассечения лимфатических узлов^24,был предотврачив разработку новых методов диагностической визуализации. Для проверки этих новых методов в доклинических условиях требуется надежная модель рака эндометрия с ретроперитонеальными метастазами лимфатических узлов.

Модель опухоли кролика VX2 является устоявшейся моделью, которая широко используется для изучения нескольких опухолей твердых органов человека^25, включая легкие^26,голову и шею^27,28, печень²⁹, почки³⁰, кости^31,32, мозг³³, поджелудочная железа³⁴ и матка^35,36,37. Модель VX2 была первоначально разработана в 1940 году Кидд и Рус³⁸ путем успешной трансплантации хлопчатобумажный вирус папилломы кролика обнаружили Shope в 1933³⁹. С тех пор модель VX2 поддерживается in vivo, требуя серийного прохождения в четырехглавой мышце белых новозеландских кроликов⁴⁰. Совсем недавно, однако, несколько групп успешно выросли VX2 клетки в пробирке^40,41,42 и продемонстрировали сохраненные tumorigenecity культивированных клеточной линии^{31, 42,43}. Опухоли VX2 гистологически определены как анапластические плоскоклеточные карциномы⁴⁴ и содержат железистые особенности, которые напоминают аденокарциному²⁶. Опухоли характеризуются простотой имплантации, быстрым ростом и гиперваскулярностью^44,45 и надежно метастазируют, чаще всего в региональные и отдаленные лимфатические узлы⁴⁵. Сходства в маточных сосудистой и лимфатической анатомии^46, а также ортотопический рост сайта обеспечить, чтобы метастатическая картина рака кролика VX2 имитирует, что из рака эндометрия человека, что делает модель VX2 надежной моделью для изучения человека метастатического заболевания. Кроме того, гистологические особенности, такие как аномальная микрососудистая пролиферация⁴⁷ , а также иммунологические⁴⁸ и генетические сходства^49,50 между людьми и кроликами предполагают, что опухоль микроокружение может отражать рак эндометрия человека.

Несколько групп сообщили об использовании VX2 для создания модели рака эндометрия с ретроперитонеальной метастазы с высоким уровнем сообщили успеха^36,51,52; однако в нынешней литературе существуют значительные различия в отношении метода создания модели. Сотовые дозы подвески как низко как 4 х 10⁵ клеток / матки рога⁵¹ и выше, чем 5 х 10⁹ клеток / матки рога^37,53 были зарегистрированы без стандартного консенсуса по требуемой дозы VX2 клеточной. Кроме того, различные методы прививки были зарегистрированы в том числе микро-хирургической имплантации опухоли в миометрию матки³⁶, инъекция VX2 клеточной суспензии^{37,44,52 , 53} и в некоторых случаях, добавление зашвы роговой матки зашивания до инноциуляции⁵². Наконец, ни одна группа не сообщила об использовании культивированных ячеек VX2 для создания этой модели. Таким образом, цель этого исследования состоит в том, чтобы продемонстрировать успешный стандартизированный метод создания модели VX2 и сообщить о первом использовании культивированных клеток VX2 для создания модели рака эндометрия с ретроперитонеальными метастазами в кролике.

Protocol

Глубокое закрытие брюшной стенки: Определите вершину брюшного разреза и похитить брюшную мышцу, ректусную мышцу и фасцию с помощью щипц. Все исследования на животных были проведены в Центре ресурсов животных (ARC), утвержденных объектов сети здравоохранения университета и в соответстви…

Representative Results

Двадцать восемь кроликов были использованы для создания модели рака эндометрия. На момент эксперимента средний вес кроликов составил 2,83 кг (2,71-3,58 кг). Опухоли матки успешно росли в 21 кроликов для общего успеха модели 75%. До включения маточных сшивок в протокол, показате…

Discussion

В этом мы сообщили о стандартизированном хирургическом методе для создания модели рака эндометрия VX2 и сообщили о первом использовании культивированных клеток VX2 для создания этой модели. Уровень опухоли 75% ниже, чем 100% процент ставка ранее сообщалось в литературе^35,<s…

Materials

11-blade scalpel, Sterile, Disposible	Aspen Surgical (VWR)	80094-086
22-gague ear vein catheter	CDMV	14332
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb)	Covidien	356718
3-0 braided absorbable suture (Polysorb)	Covidien	356718
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon	Falcon	352350
Acepromazine (Atravet)	CDMV	1047
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%)	CDMV	4363
Betadine solution (Poviodone iodine 10%)	UHN Stores	457955
Buprenorphine	McGill University
Cefazolin	UHN in-patient pharmacy	No Cat # Needed
Chlorhexidine solution	CDMV	119872
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes	Corning	354450	brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates	Corning	354408	brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates	Corning	354400	brand not important
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL	Corning	354234
DMEM/HAM F12 1:1	Life Technologies	11320	brand not important
DMSO	Caledon Lab Chem	1/10/4100
Enrofloxacin (Baytril injectable)	CDMV	11242
Falcon Tube	Corning Centri-Star	430828
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml	Life Technologies	12483020	brand/source not important
Isoflurane	UHN in-patient pharmacy	No Cat # Needed
Isohexol contrast	GE Healthcare	407141210
Meloxicam (Metacam 0.5%)	CDMV	104674
Normal Saline	House Brand (UofT Medstore)	1011
PBS	Multicell or Sigma	331-010-CL or D8537-500mL
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin)	Corning-Cellgro	CA45000-652
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)	T.C.M.F (Dr Bristow)	28-Jan-11
Surgical Glue (Tissue Adhesive)	3M Vetbond	14695B
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade	Sigma	T-6567-5X20UG
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml	Wisent Inc	325-542-EL	brand not important