En Orthotopic livmor Cancer modell med retroperitoneal lymfadenopati laget fra in vivo spredte og kultivert VX2 Cells

Summary

Denne protokollen presenterer en standardisert metode for å vokse VX2 celler i kultur og å skape en orthotopic VX2 modell av livmorkreft med retroperitoneal lymfe node metastaser i kaniner. Orthotopic livmorkreft modeller er viktig for pre-klinisk studie av romanen Imaging modaliteter for diagnostisering av lymfeknuter metastaser.

Abstract

Livmorkreft er den vanligste Gynecologic kreft i Nord-Amerika og forekomsten er økende over hele verden. Behandling består av kirurgi med eller uten adjuvant behandling avhengig av lymfe node engasjement som bestemmes av lymfadenektomi. Lymfadenektomi er en sykelig prosedyre, som ikke har vist å ha en terapeutisk fordel hos mange pasienter, og dermed en ny metode for å diagnostisere lymfeknuter metastaser er nødvendig. For å teste romanen Imaging agenter, en pålitelig modell av livmorkreft med retroperitoneal lymfe node metastaser er nødvendig. Den VX2 livmorkreft modellen har blitt beskrevet ofte i litteraturen; Imidlertid finnes betydelig variasjon med hensyn til metoden for modellen etablering. Videre har ingen studier rapportert om bruk av kulturperler VX2 celler for å lage denne modellen som bare celler overført in vivo har vært tidligere brukt. Heri, presenterer vi en standardisert kirurgisk metode og post-operative overvåking metode for etablering av VX2 livmorkreft modell og rapport om den første bruken av kultivert VX2 celler for å lage denne modellen.

Introduction

Livmorkreft, eller kreft i slimhinnen i livmoren, er den nest vanligste Gynecologic kreft verden og den vanligste kreft i utviklede land¹. Forekomsten av livmorkreft har stadig økt, stiger med 2,3% per år mellom 2005-2013 med en tilsvarende 2,2% økning i dødelighet^1,2,3. Diagnostisering av lymfeknuter metastaser er viktig som tilstedeværelsen av positive lymfeknuter er en sterk negativ indikasjon på overlevelse^4,5,6,7 og kan veilede administrasjonen av adjuvant behandling^{8,9,10,11,12,13}. Lymfeknuter metastaser er for tiden diagnostisert ved kirurgisk fjerne lymfesystemet overliggende de store blodkarene i bekkenet og magen. Denne prosedyren, kjent som en lymfadenektomi, er kontroversiell på grunn av motstridende overlevelses data fra to store forsøk^{14,15,16,17,18} og den kjente risiko for intra-operative^15,19,20 og postoperativ sykelighet^21,22,23. Som dagens ikke-invasiv Imaging modaliteter ikke har den nødvendige følsomhet og spesifisitet til å erstatte lymfeknuter disseksjon²⁴, har det vært et push for å utvikle nye diagnostiske Imaging teknikker. For å teste disse romanen teknikker i en pre-klinisk setting, en pålitelig modell av livmorkreft med retroperitoneal lymfe node metastaser er nødvendig.

The Rabbit VX2 tumor modellen er en veletablert modell som har blitt brukt i stor utstrekning for å studere flere menneskelige solide organ^{svulster 25} inkludert lunge²⁶, hode og nakke^27,28, lever²⁹, nyre³⁰, Bone^31,32, Brain³³, bukspyttkjertel³⁴ og^{livmor 35,36,37}. Det VX2 modell var opprinnelig bebygget inne 1940 av Kidd og Rous³⁸ av med hell transplantere en smukken kanin papilloma virus oppdaget av Shope inne 1933³⁹. Siden det tid, det VX2 modell er blitt holdt inne Vivo, behøver føljetong passasje inne det quadriceps muskelen av hvit New Zealand kanin⁴⁰. Flere nylig men flere grupper har blitt dyrket VX2 celler in vitro^40,41,42 og demonstrerte beholdt tumorigenecity av kultivert cellelinje^{31, 42,43}. VX2 svulster er histologisk definert som anaplastisk plateepitel celle kreftsvulster⁴⁴ og inneholder kjertel funksjoner som ligne adenokarsinom²⁶. Svulster kjennetegnes ved enkel implantation, rask vekst og Hyper-vascularity^44,45 og pålitelig metastase, oftest til regionale og fjerne lymfeknuter⁴⁵. Likheter i livmor vaskulær og lymfatisk anatomi⁴⁶ samt orthotopic vekst området sikre at metastatisk mønster av kanin VX2 kreft etterligner at menneskets livmorkreft, noe som gjør VX2 modellen en pålitelig modell for å studere menneskelig metastatisk sykdom. Videre histologic funksjoner som unormal mikrovaskulær spredning⁴⁷ , så vel som immunologiske⁴⁸ og genetiske likheter^49,50 mellom mennesker og kaniner tyder på at svulsten mikromiljøet kan gjenspeile at menneskets livmorkreft.

Flere grupper har rapportert om bruk av VX2 å lage en modell av livmorkreft med retroperitoneal metastaser med en høy rapportert rate av suksess^36,51,52; Det finnes imidlertid betydelig variasjon innenfor gjeldende litteratur med hensyn til metoden for modell opprettelse. Cell suspensjon doser så lavt som 4 x^{10 5} celler/livmor^{horn 51} og så høyt som 5 x 10⁹ celler/livmor horn^37,har⁵³ blitt rapportert uten standard konsensus om den nødvendige VX2 Cellular dose. I tillegg har en rekke inoculation metoder er rapportert inkludert mikro-kirurgisk implantation av tumor inn i livmor myometriet³⁶, injeksjon av VX2 celle suspensjon^{37,44,52 , 53} og i noen tilfeller, tilsetning av livmor horn suturing før innoculation⁵². Til slutt, ingen grupper har rapportert bruk av kultivert VX2 celler for å lage denne modellen. Således er hensikten med denne studien er å demonstrere en vellykket standardisert metode for VX2 modell opprettelse og å rapportere den første bruken av kultivert VX2 celler for å skape en modell av livmorkreft med retroperitoneal metastaser i en kanin.

Protocol

Dyp abdominal vegg lukking: Identifiser toppen av bukhulen snitt og ta tak i peritoneum, Rectus muskler og konsept med vev tang. Alle dyrestudier ble utført i Animal Resource Center (ARC) godkjent anlegg av University Health Network og i samsvar med godkjent dyr bruk og omsorg protokoller (AUP #3994/#4299). VX2 cellelinje ble innhentet fra Dr. Aken ‘ s Lab ved University Health Network. 1. opprettelse av in vitro VX2 cellelinje Høste VX2 svulst fra kanin quadricep muskelen og vekst…

Representative Results

Tyve-åtte kanin var anvendt for det kreasjon av det livmor kreften modell. Kaniner hadde en gjennomsnittlig vekt på 2,83 kg (2.71-3.58 kg) på tidspunktet for eksperimentet. Livmor tumorer hell vokste i 21 kaniner for en helhetlig modell suksess rate på 75%. Før inkludering av livmor suturing i protokollen, var suksessraten 57% sammenlignet med 81% etter livmor suturing ble lagt til. Livmor suturing ble lagt til protokollen etter 7th kanin som svar på den første lave mode…

Discussion

Heri har vi rapportert en standardisert kirurgisk metode for etablering av en VX2 livmorkreft modell og rapportert om første bruk av kultivert VX2 celler for å lage denne modellen. Svulsten tar sats på 75% er lavere enn 100% prosentsats tidligere rapportert i litteraturen^35,37,53,56; men THW 90% rate på patologisk bekreftet lymfeknuter metastaser er forenlig med tidligere studier av denne m…

Materials

11-blade scalpel, Sterile, Disposible	Aspen Surgical (VWR)	80094-086
22-gague ear vein catheter	CDMV	14332
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb)	Covidien	356718
3-0 braided absorbable suture (Polysorb)	Covidien	356718
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon	Falcon	352350
Acepromazine (Atravet)	CDMV	1047
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%)	CDMV	4363
Betadine solution (Poviodone iodine 10%)	UHN Stores	457955
Buprenorphine	McGill University
Cefazolin	UHN in-patient pharmacy	No Cat # Needed
Chlorhexidine solution	CDMV	119872
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes	Corning	354450	brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates	Corning	354408	brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates	Corning	354400	brand not important
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL	Corning	354234
DMEM/HAM F12 1:1	Life Technologies	11320	brand not important
DMSO	Caledon Lab Chem	1/10/4100
Enrofloxacin (Baytril injectable)	CDMV	11242
Falcon Tube	Corning Centri-Star	430828
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml	Life Technologies	12483020	brand/source not important
Isoflurane	UHN in-patient pharmacy	No Cat # Needed
Isohexol contrast	GE Healthcare	407141210
Meloxicam (Metacam 0.5%)	CDMV	104674
Normal Saline	House Brand (UofT Medstore)	1011
PBS	Multicell or Sigma	331-010-CL or D8537-500mL
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin)	Corning-Cellgro	CA45000-652
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)	T.C.M.F (Dr Bristow)	28-Jan-11
Surgical Glue (Tissue Adhesive)	3M Vetbond	14695B
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade	Sigma	T-6567-5X20UG
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml	Wisent Inc	325-542-EL	brand not important