En in vitro model for at studere Tau aggregering ved hjælp af Lentiviral-medieret transduktion af humane neuroner

Summary

Denne protokol beskriver en procedure, hvor menneskelige neuronal kulturer er transduceret med lentiviral konstruktioner kodning for mutant menneske Tau. Transduceret kulturer display Tau aggregater og tilknyttede patologier.

Abstract

Aberrant aggregering af protein Tau er patetisk involveret i en række neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers sygdom (AD). Selv om musemodeller af tauopati har givet en værdifuld ressource for at undersøge neurotoksiske mekanismer i aggregeret Tau, det bliver mere og mere klart, at på grund af interspecies forskelle i Neuro fysiologi, muse hjernen er uegnet til modellering af den menneskelige tilstand. Fremskridt i cellekultur metoder har gjort menneskelige neuronal kulturer tilgængelige for eksperimentel brug in vitro og har hjulpet i udviklingen af neurotherapeutics. Men på trods af tilpasningen af humane neuronal cellekulturer, in vitro modeller af human tauopati er endnu ikke bredt tilgængelige. Denne protokol beskriver en cellulær model af Tau aggregering, hvor menneskelige neuroner er transduceret med lentiviral-afledte vektorer, at koden for patogenisk muteret Tau smeltet til en gul fluorescerende protein (YFP) reporter. Transduceret kulturer producerer Tau aggregater, der pletter positivt for thioflavin og display markører for neurotoksicitet, såsom nedsat axonal længde og øget lysosomale volumen. Denne procedure kan være en nyttig og omkostningseffektiv model for at studere menneskelige tauopathier.

Introduction

Patologisk aggregering af den mikrotubule-associerede protein Tau er et definerende træk ved mange neurodegenerative sygdomme, herunder AD, frontotemporal demens (FTD), pick ‘s sygdom, og progressiv supranuclear parese (PSP)¹. I en ikke-syg tilstand binder Tau sig til og stabiliserer mikrotubulære filamenter i neuronale axoner². Men, sygdoms associeret hyperfosforylering af Tau fremmer Tau aggregering, afkobling fra microtubules, og neuronal toksicitet³. De toksiske virkninger af aggregeret Tau kan indebære afvigende aktivering af kolinerge⁴ og glutamatergic receptorer⁵ resulterer i dysregulering af intracellulære calcium og i sidste ende, celledød. I dyremodeller forbedrer reduktionen af hjernen Tau patologi i AD-mus⁶ og i musemodeller af repetitive mild traumatisk hjerneskade⁷.

Montering beviser viser, at strukturen og bindende affinitet af mus-afledte Tau adskiller sig fra menneske-afledte Tau og at musen Tau er uegnet til modellering menneskelige tauopathies⁸. Men, humane celle tauopati modeller er ikke almindeligt kommercielt tilgængelige. Det overordnede mål med dette arbejde er at beskrive en in vitro model af Tau aggregering, hvor menneskelige neuroner er transduceret med lentiviral-afledte vektorer, der indeholder mutant Human Tau konstruktioner⁹. Tau aggregat forårsager lentiviral konstruktioner koder for Tau gentage domæne husly P301L og V337M mutationer smeltet til en yfp reporter (Tau-rdlm-yfp) mens kontrol konstruerer kode for Wild-type (WT) Tau gentage domæne fusioneret til en yfp reporter (Tau-WT-yfp). Neuronal kulturer transduceret ved hjælp af denne metode udtrykke cirka ni gange mere Tau end ikke-transduceret kulturer. Selv om mængden af Tau udtryk over udtrykkes er nogenlunde lige mellem Tau-RDLM-YFP-og Tau-WT-YFP-transduceret celler, kun neuroner transduceret med Tau-RDLM-YFP display aggregater. Kulturer transduceret med Tau-RDLM-YFP bejdse positivt for thioflavin og display reduktioner i axonal længde og synaptisk tæthed. Derfor, denne cellulære model kan være et nyttigt redskab til at studere Tau aggregering in vitro.

Protocol

1. klargøring af medier og reagenser Optø kælderen membran matrix belægning for kultur plader ved 4 °C (Lad ikke kælderen membran matrix til at varme op, eller det vil størkne). Der fremstille 1 mL aliquoter, og opbevar dem ved-20 °C eller-70 °C. Den grundlæggende fibroblast vækstfaktor (bFGF) rekonstruere i sterilt fosfat-bufferet saltvand (PBS) ved 10 μg/mL og fremstille 10 μL aliquoter. Opbevar dem ved 4 °C. Til en ny, uåbnet, 500 mL flaske DMEM/F12 med glutamin, tilsæt B2…

Representative Results

Tau-rdlm-yfp-transduceret neuroner blev optælling tagget med yfp, og rdlm-transduceret kulturer viste aggregater efter transduktion. Disse inklusioner farves positivt for thioflavin (figur 1). Som figur 1 demonstrerer, denne protokol producerer neuronal kulturer, der viser thioflavin-positive Tau aggregater. For indledende eksperimenter, anbefales det, at neuronal differentiering bekræftes ved immun mærkning af neuron-specifikke markør β-Tubulin III i kultu…

Discussion

Denne protokol beskriver dannelsen af en in vitro-model af human tauopati, der udviser sølv-bejdde-positive aggregater og thioflavin-positive neurofibrillære tangles (NFTS). Desuden, transducerede celler viser Tau-induceret patologier såsom morfologiske defekter, reduceret synaptogenesis, og en øget lysosomale volumen. Den største fordel ved denne protokol er, at det giver en tilgængelig og omkostningseffektiv model af neuronal tauopati, som kan bruges til Drug screening undersøgelser, samt til analyse af Tau toks…

Materials

10 cm culture dishes	Thermofisher	12556002
15 ml tubes	Biopioneer	CNT-15
16% paraformaldehyde	Thermofisher	50-980-487
24 well culture plates	Thermofisher	930186
50ml tubes	Biopioneer	CNT-50
70% ethanol in spray bottle	Various sources	NA
B27 supplement	Thermofisher	17504044
Basement membrane matrix (Matrigel)	Corning	356231
Basic FGF	Biopioneer	HRP-0011
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
Cell culture incubator	Various sources	NA
Centrifuge	Various sources	NA
DMEM-F12 culture media with glutamine	Thermofisher	10565042
Ethanol (50% concentration or higher)	Various sources	NA
Flourescently labeled secondary antibodies	Various Sources, experiment dependent	NA
Fluorescent microscope	Various sources	NA
Glass coverslips	Thermofisher	1254581
Glass slides	Thermofisher	12-550-15
Human neural stem cells	Various sources	NA
Lentiviral vectors	Various sources	custom order
Mounting media	Thermofisher	P36934
N2 supplement	Thermofisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	Thermofisher	15140122
Phosphate buffered saline	Thermofisher	14190250
Primary antibodies	Various Sources, experiment dependent	NA
Rocking or rotating platform	Various sources	NA
Sterile cell culture hood	Various sources	NA
Thioflavin S	Sigma	T1892-25G
Triton X-100	Thermofisher	BP151-100
Water bath	Various sources	NA