ヒトニューロンのレンチウイルス媒介性形質導入を用いたタウ凝集を研究するための in Vitro モデル
Summary
このプロトコルは、ヒトの神経細胞培養が変異型ヒトタウのためのコーディングをコードするレンチを用いて形質導入される手順を詳述する。形質導入培養物は、タウ凝集体および関連する病理を表示する。
Abstract
タンパク質タウの異常な凝集は、アルツハイマー病 (AD) を含む多数の神経変性疾患に関与する pathogenically である。タウオパチーのマウスモデルは、凝集したタウの神経毒性メカニズムを調査するための貴重な資源を提供しているが、種族間の生理学的差異のために、マウス脳は人間の状態をモデリングします。細胞培養法の進歩は、インビトロでヒトニューロン培養を実験用にアクセス可能にし、neurotherapeutics の開発を支援した。しかしながら、ヒト神経細胞培養物の適応にもかかわらず、ヒトタウオパチーのインビトロモデルは未だ広く利用可能ではない。この議定書は、ヒトニューロンを pathogenically 変異体が黄色蛍光タンパク質 (YFP) レポーターに融合させるコードであるレンチウイルス由来のベクターで形質導入したタウ凝集体の細胞モデルを記述している。形質導入された培養物は、チオフラビンに対してポジティブに染色し、軸索長さの減少およびリソソーム体積の増加などの神経毒性のマーカーを表示するタウ凝集体を生成する。この手順は、人間のタウオパチーを研究するための有用で費用対効果の高いモデルかもしれません。
Introduction
微小管関連タンパクタウの病理学的凝集は、AD、前頭認知症 (FTD)、ピック病、および進行性の神経性麻痺 (PSP)1を含む多くの変性疾患の決定的な特徴である。Nondiseased 状態では、タウは神経軸索2に結合して微小管フィラメントを安定化させる。しかし、タウの疾患関連 hyperphosphorylation は、タウの凝集を促進します, 微小管からの解離, ニューロン毒性3.凝集したタウの毒性作用は、コリン作動性4および glutamatergic 受容体5の異常な活性化を伴うことがあり、細胞内カルシウムの調節不全をもたらし、最終的に、細胞死をもたらす。動物モデルにおいて、脳タウの減少は、AD マウス6における病理を改善し、反復性の軽度トラウマ的脳損傷7のマウスモデルである。
取り付け証拠は、マウス由来タウの構造および結合親和性がヒト由来タウとは異なること、およびマウスタウがヒトタウオパチー8のモデル化に適さないことを実証する。しかしながら、ヒト細胞タウオパチーモデルは、広く市販されていない。本研究の全体的な目的は、ヒトニューロンが変異型ヒトタウ構築物9を含むレンチウイルス由来ベクターで形質導入されるタウ凝集の in vitro モデルを記述することである。YFP レポーターに融合した P301L および V337M 突然変異を保有するタウ繰り返しドメインについてのタウレンチコンストラクトを生じさせるτ凝集体 (τ-RDLM-YFP) に対して、制御構築物は野生型 (Wt) タウのコードを YFP レポーター (タウ− Wt − YFP) に融合させた。この方法を用いて形質導入したニューロン培養は、nontransduced 培養よりも約9倍多くのタウを発現する。タウの発現量は、タウ-RDLM-YFP-YFP 形質細胞との間でほぼ等しいですが、タウ-RDLM-YFP ディスプレイで形質導入されたニューロンのみが凝集します。RDLM-YFP 染色によって形質導入された培養物は、チオフラビンのためにポジティブに、軸索長さおよびシナプス密度の減少を表示する。したがって、この細胞モデルは、インビトロでタウ凝集を研究するための有用なツールとなり得る。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、銀染色陽性凝集体およびチオフラビン陽性脱落もつれ (NFTs) を呈するヒトタウオパチーの in vitro モデルの生成を記述する。さらに、形質導入細胞は、形態学的欠陥、減少したシナプス形成、および増加したリソソーム容積のようなタウ誘発病理を表示する。このプロトコルの主な利点は、薬物スクリーニング研究のためだけでなく、タウ毒性の分析のために使用すること?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者たちは、タウコンストラクトを提供するために、テキサス大学南西部で PHF と CP13 抗体とマルク・ダイヤモンドを供給するために、アルバート・アインシュタイン医科大学のピーター・デイビス博士に感謝したいと思います。この研究は、アルツハイマー病協会 (NIRG-14-322164) から S.H.Y. とカリフォルニア再生医療研究所 (TB1-01193) からの助成金によって支持されました P.R.
Materials
| 10 cm culture dishes | Thermofisher | 12556002 | |
| 15 ml tubes | Biopioneer | CNT-15 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermofisher | 50-980-487 | |
| 24 well culture plates | Thermofisher | 930186 | |
| 50ml tubes | Biopioneer | CNT-50 | |
| 70% ethanol in spray bottle | Various sources | NA | |
| B27 supplement | Thermofisher | 17504044 | |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Basic FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| Cell culture incubator | Various sources | NA | |
| Centrifuge | Various sources | NA | |
| DMEM-F12 culture media with glutamine | Thermofisher | 10565042 | |
| Ethanol (50% concentration or higher) | Various sources | NA | |
| Flourescently labeled secondary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Fluorescent microscope | Various sources | NA | |
| Glass coverslips | Thermofisher | 1254581 | |
| Glass slides | Thermofisher | 12-550-15 | |
| Human neural stem cells | Various sources | NA | |
| Lentiviral vectors | Various sources | custom order | |
| Mounting media | Thermofisher | P36934 | |
| N2 supplement | Thermofisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Thermofisher | 14190250 | |
| Primary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Rocking or rotating platform | Various sources | NA | |
| Sterile cell culture hood | Various sources | NA | |
| Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
| Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
| Water bath | Various sources | NA |
References
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