מודל בלתי מתורבת לחקר הצבירה של הטאו באמצעות מתווך-התמרה בתיווך של הנוירונים האנושיים
Summary
פרוטוקול זה מפרט הליך שבו התרבויות הנוירואליות של האדם מוטדיקות באמצעות בנייה ויראלית קידוד עבור מוטציה האדם האנושי. התמרה של תרבויות התצוגה ביחידות האוניברסיטה והפתווגיות הקשורות.
Abstract
צבירה חריגה של החלבון טאו מעורב באופן פתולוגי במספר מחלות ניווניות, כולל מחלת אלצהיימר (AD). למרות שדגמי העכבר של טאונופתיה סיפקו משאב בעל ערך לחקירת מנגנוני הנוירורעילים של האוניברסיטה הנצברת, הוא הופך להיות יותר ויותר ברור כי, בשל הבדלים בין מינים נוירופיזיולוגיה, המוח בעכבר אינו מתאים ל מידול המצב האנושי. ההתקדמות בשיטות תרבות התאים הפכו את התרבויות העצבי האנושיות לנגישות לשימוש ניסיוני בתחום החוץ וסייעו בפיתוח הneurotherapeutics. עם זאת, למרות ההסתגלות של תרבויות התאים הנוירואליות האנושית, במודלים של מבחנה של הטאופתיה האנושית עדיין אינם זמינים באופן נרחב. פרוטוקול זה מתאר את המודל התאי של הצבירה של הטאו שבו הנוירונים האנושיים מותמרים עם וקטורים הנגזרים מהאנטי-ויראליות הקוד עבור מוטציה בפתוניים התמזגו לכתב חלבון פלורסנט צהוב (YFP). תרבויות התמרה לייצר אגרגטים טאו הכתם באופן חיובי עבור thioflavin ולהציג סמנים של רעילות נוירולית, כגון אורך האקסון הופחת ונפח ליסוזומגדל. הליך זה עשוי להיות מודל שימושי וחסכוני ללימוד tauopathies אנושיים.
Introduction
צבירה פתולוגית של המיקרו-מחלות החלבון המקושר היא תכונה מוגדרת של הרבה במחלות ניווניות, כולל לספירה, דמנציה מתקדמת (ftd), מחלת ברים, ושיתוק מוחין גרעיני (PSP)1. במדינה שאינה חולה, מאוגד הטאו ומייצב את החוטים המיקרוסיבים העצביים ב-2. עם זאת, היפרזילציה הקשורים למחלות של הטאו מקדמת את צבירת הטאו, דיסוציאציה ממיקרוטובולים ורעילות עצבית3. ההשפעות הרעילות של הטאו הצבור עשוי להיות כרוך הפעלה חריגה של cholinergic4 ו glutamatergic קולטנים5 וכתוצאה מכך דיסתקנה של סידן תאיים ובסופו של דבר, מוות תאים. במודלים של בעלי חיים, הפחתת המוח המוחי משפרת את הפתולוגיה בעכברי לספירה6 ובדגמי העכבר של פגיעה מוחית טראומטית מתונה וחוזרת7.
ראיות הרכבה מעידות על כך שהמבנה והזיקה המחייבים של הטאו הנגזר מהעכבר נבדלים מטאו שנגזר על ידי האדם והעכבר טאו אינו מתאים לדוגמנות האדם tauopathies8. עם זאת, מודלים של תאי תאים אנושיים אינם זמינים מבחינה מסחרית. המטרה הכוללת של עבודה זו היא לתאר מודל בלתי מתורבת של הצבירה של הטאו שבו הנוירונים האנושיים מותמרים עם וקטורים הנגזרים המכילים מוטציה האדם בונה9. טאו הצבירה גרימת בנייה ויראלי מקודד לתחום החוזר של טאו מחסה P301L ו V337M מוטציות התמזגו כתבת YFP (טאו-RDLM-YFP) תוך שליטה בונה קוד עבור מסוג פראי (Wt) טאו לחזור התחום התמזגו לכתב YFP (טאו-Wt-YFP). התרבויות הנוירואליות משדיקות בשיטה זו מבטאות כתשע פעמים יותר טאו מאשר תרבויות שאינן מנתמרים. למרות שכמות הביטוי של הטאו מתבטאת במידה רבה בין התאים של טאו-RDLM-YFP-ובין טאו-אווט-יfp, רק נוירונים מותמרים ביחידות התצוגה של הטאו-RDLM. התרבויות התמרה את האור בעזרת טאו-rdlm-yfp באופן חיובי עבור thioflavin ולהציג הנחות באורך סיבי וצפיפות סינפטית. לכן, המודל התאי הזה עשוי להיות כלי שימושי לחקר הצבירה של הטאו בתוך מבחנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את הדור של מודל בלתי מתורבת של טאונופתיה האנושית שמוצגים כסף-כתם חיובי אגרגטים ו thioflavin-חיובי נוירופיבריליאן סבך. יתר על כן, תאים התמרה להציג הפתולוגית המושרה טאו כגון פגמים מורפולוגיים, synaptogenesis מופחתת, ונפח ליסוזוממוגבר. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מספק מודל נגי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לד ר פיטר דייויס במכללת אלברט איינשטיין לרפואה בגין אספקת הנוגדנים PHF-1 ו-CP13 ו ד ר מארק דיאמונד באוניברסיטת טקסס, בדרום-מערב, למתן מבנים של הטאו. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים של האגודה לאלצהיימר (נירנברג g-14-322164) כדי S.H.Y. ומהמכון קליפורניה לרפואה רגנרטיבית (TB1-01193) ליחסי ציבור
Materials
| 10 cm culture dishes | Thermofisher | 12556002 | |
| 15 ml tubes | Biopioneer | CNT-15 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermofisher | 50-980-487 | |
| 24 well culture plates | Thermofisher | 930186 | |
| 50ml tubes | Biopioneer | CNT-50 | |
| 70% ethanol in spray bottle | Various sources | NA | |
| B27 supplement | Thermofisher | 17504044 | |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Basic FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| Cell culture incubator | Various sources | NA | |
| Centrifuge | Various sources | NA | |
| DMEM-F12 culture media with glutamine | Thermofisher | 10565042 | |
| Ethanol (50% concentration or higher) | Various sources | NA | |
| Flourescently labeled secondary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Fluorescent microscope | Various sources | NA | |
| Glass coverslips | Thermofisher | 1254581 | |
| Glass slides | Thermofisher | 12-550-15 | |
| Human neural stem cells | Various sources | NA | |
| Lentiviral vectors | Various sources | custom order | |
| Mounting media | Thermofisher | P36934 | |
| N2 supplement | Thermofisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Thermofisher | 14190250 | |
| Primary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Rocking or rotating platform | Various sources | NA | |
| Sterile cell culture hood | Various sources | NA | |
| Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
| Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
| Water bath | Various sources | NA |
References
- Rojas, J. C., Boxer, A. L. Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).
- Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
- Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).
- Gomez-Ramos, A., et al. Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein. European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).
- Warmus, B. A., et al. Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).
- DeVos, S. L., et al. Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo. Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).
- Cheng, J. S., et al. Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice. PLOS ONE. 9 (12), e115765 (2014).
- Ando, K., et al. Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model. The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).
- Reilly, P., et al. Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation. Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).
- Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species. The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).
- Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PLOS ONE. 6 (3), e17540 (2011).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Passaging human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e263 (2007).
- Lathuiliere, A., et al. Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects. Scientific Reports. 7 (1), 13556 (2017).
- Asai, H., et al. Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation. Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).
