Um modelo in vitro para estudar a agregação Tau usando transdução mediada por Lentivirus de neurônios humanos

Summary

Este protocolo detalha um procedimento em que as culturas neuronal humanas são transadas com construções lentivirais que codificam para o Tau humano do mutante. As culturas transadas exibem agregados Tau e patologias associadas.

Abstract

A agregação aberrante da proteína Tau é patogenicamente envolvida em um número de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (AD). Embora os modelos de rato de Taupatia forneceram um recurso valioso para investigar os mecanismos neurotóxicos da Tau agregada, está tornando-se cada vez mais aparente que, devido às diferenças do entre espécies na neurofisiologia, o cérebro do rato é inadequado para modelar a condição humana. Os avanços nos métodos de cultura celular tornaram as culturas neuronais humanas acessíveis para uso experimental in vitro e ajudaram no desenvolvimento de neuroterapêutica. No entanto, apesar da adaptação de culturas de células neuronais humanas, in vitro modelos de tauopatia humana ainda não estão amplamente disponíveis. Este protocolo descreve um modelo celular da agregação da Tau em que os neurônios humanos são transfundidos com os vetores lentiviral-derivados esse código para Tau patogenicamente mutado fundido a um repórter amarelo da proteína fluorescente (YFP). Culturas transdoadas produzem agregados Tau que mancham positivamente para a tioflavina e exibem marcadores de neurotoxicidade, tais como diminuição do comprimento axonal e aumento do volume lisossomal. Este procedimento pode ser um modelo útil e rentável para estudar tauopathies humanas.

Introduction

A agregação patológica da proteína Tau microtubule-associada é uma característica definidora de muitas doenças neurodegenerativas, incluindo a AD, a demência frontotemporal (FTD), a doença de pick, e a paralisia supranuclear progressiva (PSP)¹. Em um estado não-doente, a Tau liga-se e estabiliza os filamentos de microtúse em axônios neuronais². No entanto, a hiperfosforilação associada à doença da Tau promove a agregação de Tau, a dissociação dos microtúbulos e a toxicidade neuronal³. Os efeitos tóxicos da Tau agregada podem envolver a ativação aberrante de⁴ e receptores glutamatérgicos colinérgicos⁵ resultando na desregulação do cálcio intracelular e, eventualmente, morte celular. Em modelos animais, a redução da Tau cerebral melhora a patologia em camundongos AD⁶ e em modelos de mouse de lesão cerebral traumática leve repetitiva⁷.

A evidência da montagem demonstra que a estrutura e a afinidade obrigatória da Tau rato-derivada são distintas da Tau Human-derivada e que o Tau do rato é inadequado para modelar Tauopatias humanos⁸. Entretanto, os modelos Taupatia da pilha humana não são extensamente disponíveis comercialmente. O objetivo geral deste trabalho é descrever um modelo in vitro de agregação Tau em que os neurônios humanos são transviados com vetores derivados de lentivirais contendo construções de Tau humanas mutantes⁹. Tau agregado causando lentivirais constrói codifica para o domínio de repetição Tau abrigando P301L e V337M mutações fundidas a um repórter YFP (Tau-rdlm-YFP) enquanto o controle constrói código para o Wild-Type (WT) Tau repetir domínio fundido a um repórter YFP (Tau-WT-YFP). As culturas neuronal transectoadas usando este método expressam aproximadamente nove vezes mais Tau do que culturas nontransemadas. Embora a quantidade de expressão de Tau superexpressa seja aproximadamente igual entre as células Tau-RDLM-YFP-e Tau-WT-YFP-transvadas, apenas os neurônios transvados com agregados de exibição de Tau-RDLM-YFP. As culturas transvadas com Tau-RDLM-YFP mancham positivamente para a tioflavina e apresentam reduções no comprimento axonal e na densidade sináptica. Portanto, este modelo celular pode ser uma ferramenta útil para estudar a agregação de Tau in vitro.

Protocol

1. preparação de meios de comunicação e reagentes Descongelar o revestimento da matriz da membrana do porão para placas da cultura em 4 ° c (não permita que a matriz da membrana do porão aqueça acima ou solidify). Fazer alíquotas de 1 mL e armazená-las a-20 ° c ou-70 ° c. Reconstituir o fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) em soro fisiológico tampão fosfato estéril (PBS) a 10 μg/mL e fazer 10 μL de alíquotas. Guarde-os a 4 ° c. Para um novo, não aberto, 50…

Representative Results

Os neurônios de Tau-RDLM-YFP-transdução foram marcados fluorescentamente com o YFP, e as culturas RDLM-dueadas apresentaram agregados após a transdução. Essas inclusões coradas positivas para a tioflavina (Figura 1). Como a Figura 1 demonstra, este protocolo produz culturas neuronais que exibem agregados de Tau tioflavina-positivos. Para experimentos iniciais, recomenda-se que a diferenciação neuronal seja confirmada Immunolabeling o marcador Neuron-esp…

Discussion

Este protocolo descreve a geração de um modelo in vitro de Taupatia humano que exiba agregados prata-mancha-positivos e emaranhados neurofibrilary thioflavin-positivos (NFTS). Além disso, as pilhas transfuídas exibem patologias Tau-induzidas tais como defeitos morfológicos, synaptogenesis reduzido, e um volume lysosomal aumentado. A principal vantagem deste protocolo é que ele fornece um modelo acessível e rentável de tauopatia neuronal, que pode ser usado para estudos de triagem de drogas, bem como para a análi…

Materials

10 cm culture dishes	Thermofisher	12556002
15 ml tubes	Biopioneer	CNT-15
16% paraformaldehyde	Thermofisher	50-980-487
24 well culture plates	Thermofisher	930186
50ml tubes	Biopioneer	CNT-50
70% ethanol in spray bottle	Various sources	NA
B27 supplement	Thermofisher	17504044
Basement membrane matrix (Matrigel)	Corning	356231
Basic FGF	Biopioneer	HRP-0011
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
Cell culture incubator	Various sources	NA
Centrifuge	Various sources	NA
DMEM-F12 culture media with glutamine	Thermofisher	10565042
Ethanol (50% concentration or higher)	Various sources	NA
Flourescently labeled secondary antibodies	Various Sources, experiment dependent	NA
Fluorescent microscope	Various sources	NA
Glass coverslips	Thermofisher	1254581
Glass slides	Thermofisher	12-550-15
Human neural stem cells	Various sources	NA
Lentiviral vectors	Various sources	custom order
Mounting media	Thermofisher	P36934
N2 supplement	Thermofisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	Thermofisher	15140122
Phosphate buffered saline	Thermofisher	14190250
Primary antibodies	Various Sources, experiment dependent	NA
Rocking or rotating platform	Various sources	NA
Sterile cell culture hood	Various sources	NA
Thioflavin S	Sigma	T1892-25G
Triton X-100	Thermofisher	BP151-100
Water bath	Various sources	NA