En in vitro modell for å studere tau aggregering bruke Lentiviral-mediert Transduction av Human neurons

Summary

Denne protokollen detaljer en prosedyre der menneskelige neuronal kulturer er transduced med lentiviral konstruerer koding for mutant menneskelig tau. Transduced kulturer vise tau aggregater og tilhørende patologi.

Abstract

Avvikende aggregering av protein tau er pathogenically involvert i en rekke nevrodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom (AD). Selv om musemodeller av tauopathy har gitt en verdifull ressurs for å undersøke nevrotoksiske mekanismer for aggregert tau, blir det stadig tydeligere at, på grunn av interspecies forskjeller i nevrofysiologi, er musen hjernen uegnet for modellering av den menneskelige tilstand. Fremskritt i cellekultur metoder har gjort menneskelige neuronal kulturer tilgjengelig for eksperimentell bruk in vitro og har hjulpet i utviklingen av neurotherapeutics. Men til tross for tilpasning av menneskelig neuronal cellekulturer, in vitro modeller av menneskelig tauopathy er ennå ikke allment tilgjengelig. Denne protokollen beskriver en mobil modell av tau aggregering der menneskelige neurons er transduced med lentiviral-avledet vektorer som koden for pathogenically mutert tau smeltet til et gult fluorescerende protein (YFP) reporter. Transduced kulturer produserer tau aggregater som flekken positivt for thioflavin og vise markører for nevrotoksisitet, slik som redusert axonal lengde og økt lysosomal volum. Denne prosedyren kan være en nyttig og kostnadseffektiv modell for å studere menneskelig tauopathies.

Introduction

Patologisk aggregering av mikrotubulinettverket-assosiert protein tau er et definerende trekk ved mange nevrodegenerative sykdommer, inkludert AD, frontotemporal demens (FTD), pick ‘ s sykdom, og progressiv supranuclear parese (PSP)¹. I en nondiseased tilstand, tau binder seg til og stabiliserer mikrotubulinettverket filamenter i neuronal axons². Men, sykdom-assosiert hyperphosphorylation av tau fremmer tau aggregering, dissosiasjon fra mikrotubuli, og neuronal toksisitet³. Den toksiske effekter av aggregert tau kan innebære avvikende aktivering av kolinerge⁴ og glutamatergic reseptorer⁵ resulterer i feilregulering av intracellulære kalsium og, til slutt, celle død. I dyremodeller, reduksjon av hjernen tau forbedrer patologi i AD mus⁶ og i musemodeller av repeterende milde traumatisk hjerneskade⁷.

Montering bevis viser at strukturen og bindende affinitet av mus-avledet tau er forskjellig fra menneske-avledet tau og at musen tau er uegnet for modellering menneskelig tauopathies⁸. Men menneskelige celle tauopathy modeller er ikke allment kommersielt tilgjengelig. Det overordnede målet med dette arbeidet er å beskrive en in vitro modell av tau aggregering der menneskelige neurons er transduced med lentiviral-avledet vektorer som inneholder mutant menneskelige tau konstruksjoner⁹. Tau aggregat forårsaker lentiviral konstruerer koder for tau gjenta domenet harboring P301L og V337M mutasjoner smeltet til en YFP reporter (tau-RDLM-YFP) mens kontroll konstruerer kode for Wild-type (WT) tau gjenta domenet smeltet til en YFP reporter (tau-WT-YFP). Neuronal kulturer transduced bruker denne metoden uttrykke omtrent ni ganger mer tau enn nontransduced kulturer. Selv om mengden tau uttrykk overexpressed er omtrent lik mellom tau-RDLM-YFP-og tau-WT-YFP-transduced celler, bare neurons transduced med tau-RDLM-YFP display aggregater. Kulturer transduced med tau-RDLM-YFP flekken positivt for thioflavin og vise reduksjoner i axonal lengde og Synaptic tetthet. Derfor kan denne cellulære modellen være et nyttig verktøy for å studere tau aggregering in vitro.

Protocol

1. utarbeidelse av media og reagenser Tine kjelleren membranen matrise belegg for kultur plater ved 4 ° c (ikke la kjelleren membran matrise å varme opp eller det vil stivne). Lag 1 mL alikvoter og oppbevar dem ved-20 ° c eller-70 ° c. Rekonstituer grunnleggende Fibroblast vekstfaktor (bFGF) i sterilt fosfat-bufret saltvann (PBS) ved 10 μg/mL og gjør 10 μL alikvoter. Oppbevar dem ved 4 ° c. Til en ny, uåpnet, 500 mL flaske DMEM/F12 med glutamin, tilsett B27 (10 mL), N2 (5 mL), og pe…

Representative Results

Tau-RDLM-YFP-transduced neurons ble fluorescensmerkete merket med YFP, og RDLM-transduced kulturer vises aggregater etter Transduction. Disse inkluderinger farget positivt for thioflavin (figur 1). Som figur 1 demonstrerer, denne protokollen produserer neuronal kulturer som viser thioflavin-positive tau aggregater. For innledende eksperimenter, anbefales det at neuronal differensiering er bekreftet av immunolabeling den Nevron-spesifikke markør β-tubulin III i…

Discussion

Denne protokollen beskriver generering av en in vitro modell av menneskelig tauopathy som viser sølv-beis-positive aggregater og thioflavin-positive neurofibrillary floker (NFTs). Videre transduced celler viser tau-indusert patologi som morfologiske defekter, redusert synaptogenesis, og en økt lysosomal volum. Den største fordelen med denne protokollen er at det gir en tilgjengelig og kostnadseffektiv modell av neuronal tauopathy, som kan brukes til narkotika screening studier, samt for analyse av tau toksisitet. Denn…

Materials

10 cm culture dishes	Thermofisher	12556002
15 ml tubes	Biopioneer	CNT-15
16% paraformaldehyde	Thermofisher	50-980-487
24 well culture plates	Thermofisher	930186
50ml tubes	Biopioneer	CNT-50
70% ethanol in spray bottle	Various sources	NA
B27 supplement	Thermofisher	17504044
Basement membrane matrix (Matrigel)	Corning	356231
Basic FGF	Biopioneer	HRP-0011
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
Cell culture incubator	Various sources	NA
Centrifuge	Various sources	NA
DMEM-F12 culture media with glutamine	Thermofisher	10565042
Ethanol (50% concentration or higher)	Various sources	NA
Flourescently labeled secondary antibodies	Various Sources, experiment dependent	NA
Fluorescent microscope	Various sources	NA
Glass coverslips	Thermofisher	1254581
Glass slides	Thermofisher	12-550-15
Human neural stem cells	Various sources	NA
Lentiviral vectors	Various sources	custom order
Mounting media	Thermofisher	P36934
N2 supplement	Thermofisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	Thermofisher	15140122
Phosphate buffered saline	Thermofisher	14190250
Primary antibodies	Various Sources, experiment dependent	NA
Rocking or rotating platform	Various sources	NA
Sterile cell culture hood	Various sources	NA
Thioflavin S	Sigma	T1892-25G
Triton X-100	Thermofisher	BP151-100
Water bath	Various sources	NA