Detta protokoll specificerar ett förfarande där mänskliga neuronala kulturer är transducerade med lentiviral konstruktioner kodning för muterade mänskliga Tau. Transduced kulturer visar Tau aggregat och tillhör ande patologier.
Aberrant agg regering av proteinet Tau är patogeniskt involverad i ett antal neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Alzheimers sjukdom (AD). Även mus modeller av tauopati har gett en värdefull resurs för att undersöka de neurotoxiska mekanismerna för aggregerade Tau, det blir alltmer uppenbart att, på grund av skillnader mellan arterna i neurofysiologi, mus hjärnan är olämplig för modellering av människans tillstånd. Framsteg inom cell odlings metoder har gjort humana neuronala kulturer tillgängliga för experimentell användning in vitro och har hjälpt till med utvecklingen av neurotherapeutics. Men trots anpassningen av mänskliga neuronala cell kulturer, in vitro-modeller av mänsklig tauopati är ännu inte allmänt tillgängliga. Detta protokoll beskriver en cellulär modell av Tau agg regering där mänskliga nerv celler är transducerade med lentiviral-derived vektorer som kod för patogent muterade Tau smält till en gul fluorescerande protein (YFP) reporter. Transduced kulturer producerar Tau aggregat som fläcken positivt för tioflavin och Visa markörer för neurotoxicitet, såsom minskad axonal längd och ökad lysosomala volym. Detta förfarande kan vara en användbar och kostnads effektiv modell för att studera mänskliga tauopatier.
Patologisk agg regering av det mikrotubuliassocierade proteinet Tau är ett utmärkande drag för många neurodegenerativa sjukdomar, inklusive AD, frontotemporallobsdemens DEMENS (FTD), Pick ‘ s disease, och Progressiv Supranukleär Pares (PSP)1. I ett nondiseased tillstånd binder Tau till och stabiliserar mikrotubulefilament i neuronala axoner2. Emellertid, sjukdomsassocierad hyperfosforylering av Tau främjar Tau aggregation, dissociation från Mikrotubuli, och neuronala toxicitet3. De toxiska effekterna av aggregerade Tau kan innebära avvikande aktivering av kolinerga4 och glutamatergic receptorer5 resulterar i Dysreglering av intracellulära kalcium och, så småningom, celldöd. I djur modeller förbättrar minskningen av hjärnan Tau patologi i AD-möss6 och i mus modeller av repetitiva mild traumatisk hjärn skada7.
Montering bevis visar att strukturen och bindningsaffinitet av mus-härledda Tau skiljer sig från mänskligt framställda Tau och att musen Tau är olämpligt för modellering mänskliga tauopatier8. Emellertid, mänskliga celler tauopati modeller är inte allmänt kommersiellt tillgängliga. Det övergripande målet med detta arbete är att beskriva en in vitro-modell av Tau agg regering där mänskliga nerv celler är transducerade med lentiviral-härledda vektorer som innehåller muterade mänskliga Tau konstruktioner9. Tau aggregat orsakar lentiviral konstruktioner kodar för Tau upprepa domän hyser P301L och V337M mutationer smält till en yfp reporter (Tau-rdlm-yfp) medan kontroll konstruerar kod för Wild-Type (WT) Tau upprepa domän smält till en yfp reporter (Tau-WT-yfp). Neuronala kulturer transducerade med denna metod uttrycka cirka nio gånger mer Tau än icke-transducerade kulturer. Även om mängden Tau uttryck överuttrycks är ungefär lika mellan Tau-RDLM-YFP-och Tau-WT-YFP-transducerade celler, endast neuroner transducerade med Tau-RDLM-YFP Visa aggregat. Kulturer transducerade med Tau-RDLM-YFP fläcken positivt för thioflavin och Visa minskningar i axonal längd och synaptisk densitet. Därför kan denna cellulära modell vara ett användbart verktyg för att studera Tau aggregation in vitro-.
Detta protokoll beskriver generering av en in vitro-modell av mänsklig tauopati som uppvisar silver-fläck-positiva aggregat och tioflavin-positiva neurofibrillär trasor (NFTs). Dessutom, transducerade celler visar Tau-inducerad patologier såsom morfologiska defekter, minskad synaptogenes, och en ökad lysosomala volym. Den största fördelen med detta protokoll är att det ger en tillgänglig och kostnads effektiv modell av neuronala tauopati, som kan användas för drog screening studier, samt för analys av Tau tox…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr Peter Davies på Albert Einstein College of Medicine för att leverera PHF-1 och CP13 anti kroppar och Dr Marc Diamond vid University of Texas, sydvästra, för att ge Tau konstrukter. Detta arbete stöddes av bidrag från Alzheimer ‘ s Association (NIRG-14-322164) till S.H.Y. och från California Institute for regenerativ Medicine (TB1-01193) till P.R.
10 cm culture dishes | Thermofisher | 12556002 | |
15 ml tubes | Biopioneer | CNT-15 | |
16% paraformaldehyde | Thermofisher | 50-980-487 | |
24 well culture plates | Thermofisher | 930186 | |
50ml tubes | Biopioneer | CNT-50 | |
70% ethanol in spray bottle | Various sources | NA | |
B27 supplement | Thermofisher | 17504044 | |
Basement membrane matrix (Matrigel) | Corning | 356231 | |
Basic FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
Cell culture incubator | Various sources | NA | |
Centrifuge | Various sources | NA | |
DMEM-F12 culture media with glutamine | Thermofisher | 10565042 | |
Ethanol (50% concentration or higher) | Various sources | NA | |
Flourescently labeled secondary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
Fluorescent microscope | Various sources | NA | |
Glass coverslips | Thermofisher | 1254581 | |
Glass slides | Thermofisher | 12-550-15 | |
Human neural stem cells | Various sources | NA | |
Lentiviral vectors | Various sources | custom order | |
Mounting media | Thermofisher | P36934 | |
N2 supplement | Thermofisher | 17502048 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | |
Phosphate buffered saline | Thermofisher | 14190250 | |
Primary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
Rocking or rotating platform | Various sources | NA | |
Sterile cell culture hood | Various sources | NA | |
Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
Water bath | Various sources | NA |