الجيل السريع من الخلايا الصباغية الأولية Murine والثقافات الليفية
Summary
يحدد هذا البروتوكول طريقة سريعة لتوليد الثقافات الخلايا الصباغية والليفية في وقت واحد من جلد الفئران القديمة 0-4 أيام. يمكن الحفاظ على هذه الثقافات الأولية والتلاعب بها في المختبر لدراسة مجموعة متنوعة من العمليات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، بما في ذلك بيولوجيا خلايا الجلد، والتصبغ، والتئام الجروح والورم الميلانيني.
Abstract
ترتبط العيوب في وظيفة الخلايا الليفية أو الصباغية مع الأمراض الجلدية، بما في ذلك ضعف وظيفة الحاجز، والتئام الجروح المعيبة، وعيوب التصبغ والسرطان. ومن الأمور الحيوية لفهم هذه الأمراض وتحسينها التجارب في الثقافات الليفية الأولية والخلايا الصباغية. ومع ذلك، تتطلب البروتوكولات الحالية لعزل الخلايا الصباغية أن الطبقات الجلدية والجلدية من الجلد يتم علاجها وفصلها يدويا. وتستغرق هذه العملية وقتا طويلا، وتنطوي على تحديات تقنية، وتسهم في عدم اتساق الغلة. وعلاوة على ذلك، فإن أساليب توليد الثقافات الليفية النقية في وقت واحد من نفس عينة الأنسجة ليست متاحة بسهولة. هنا، ونحن نصف بروتوكول محسنة لعزل الخلايا الصباغية والخلايا الليفية من جلد الفئران في أيام ما بعد الولادة 0-4. في هذا البروتوكول، يتم تجانس الجلد كله ميكانيكيا باستخدام المروحية الأنسجة ومن ثم هضمها لفترة وجيزة مع الكولاجين والتربسين. ثم يتم عزل مجموعات الخلايا من خلال الطلاء الانتقائي متبوعاً بمعاملة G418. ينتج عن هذا الإجراء غلة الخلايا الصباغية والليفية المتسقة من فأر واحد في أقل من 90 دقيقة. هذا البروتوكول هو أيضا قابلة للتحجيم بسهولة، مما يسمح للباحثين لمعالجة مجموعات كبيرة من الحيوانات دون زيادة كبيرة في التدريب العملي على الوقت. نبين من خلال تقييمات قياس التدفق أن الثقافات التي أنشئت باستخدام هذا البروتوكول غنية بدرجة عالية للخلايا الصباغية أو الخلايا الليفية.
Introduction
جلد الثدييات هو جهاز متعدد الطبقات يحمي الجسم من مسببات الأمراض الأجنبية والتشعيع فوق البنفسجي (UVR). الجلد يلعب أيضا دورا حاسما في العمليات المثلية مثل التئامالجروح، وتنظيم درجة الحرارة وإنتاج فيتامين (د) 1،2،3. يتكون جلد الثدييات من ثلاثة أنواع رئيسية من الخلايا: الخلايا الصباغية، الخلايا الليفية والكيراتينية. هذه الأنواع من الخلايا ملء طبقات مختلفة من الجلد، مع الخلايا الكيراتينية التي تشكل البشرة، الخلايا الليفية المقيمة في الأدمةوالخلايا الصباغية توطين إلى تقاطع البشرة الجلدية وبصيلات الشعر 4. هنا، نقوم بتفصيل إجراء بسيط يمكّن الجيل المتزامن من الخلايا الصباغية الأولية والثقافات الليفية من جلد المورين.
الخلايا الصباغية هي الخلايا المنتجة للأصباغ الموجودة في العديد من المواقع في جميع أنحاء جسم الإنسان، بمافي ذلك البشرة القاعدية، القزحية، القوقعة، الدماغ وبصيلا الشعر 5. الوظيفة الأساسية للخلايا الصباغية هي توليد وتفرز الحويصلات التي تحتوي على الميلانين تسمى melanosomes5،6. الميلانين تحتوي على فئتين رئيسيتين من الميلانين: البني / الأسود eumelanin والأصفر / الأحمر فيوميلانين6،7. العمليات البيوكيميائية داخل الخلايا الصباغية تنظيم الوفرة النسبية لكل نوع من أنواع الميلانين وتساعد على تحديد الشعر والجلد ولون العين8،9. الميلانين يعمل أيضا على امتصاص UVR وحماية الأنسجة المعرضة للشمس من الطفرات10.
يمكن أن يسبب خلل الخلايا الصباغية عيوبًا صباغية ويزيد من قابلية الإصابة بسرطان الجلد. على سبيل المثال، بقع الجلد فرط التصبغ مميزة من الكلف هي نتيجة للإفراط في إنتاج الميلانين البؤري، في حين أن الطفرات الوراثية الجرثومية التي تضر الجينات المشاركة في تخليق الميلانين تؤدي إلى المهق11،12 . مطلوب معرفة حميمة من بيولوجيا الخلايا الصباغية لوضع استراتيجيات من شأنها تصحيح هذه العيوب الصباغية وتحسين في نهاية المطاف الرفاه النفسي والاجتماعي للأفراد المصابين بهذه الأمراض. ويرتبط العجز في إنتاج الميلانين و / أو التوليف التفضيلي للفيوميلانين أيضا مع زيادة خطر سرطان الجلد10. ويعتقد أن هذا الخطر ينتج عنانخفاض حماية UVR 6،13. وهكذا, طرق لتعزيز أو استعادة إنتاج eumelanin في الخلايا الصباغية قد يقلل من حدوث سرطان الجلد في هذه التجمعات السكانية.
الخلايا الليفية mesenchymal إنشاء النسيج الضام والدعم الهيكلي لجميع أجهزة الجسم، بما في ذلك طبقة الجلد من الجلد14. إفراز البروتينات مثل الكولاجين والإيلاستين واللامينين والفيبرونكتين تمكن الخلايا الليفية لتشكيل المصفوفة خارج الخلية (ECM) التي هي ضرورية لسلامة الأنسجة1،14. كما تلعب الخلايا الليفية أدوارًا أساسية في عمليات مثل التئام الجروح، والالتهاب، وتكوين الأوعية الدموية، وتكوين/تقدم السرطان1،15،16.
على غرار الخلايا الصباغية، يمكن أن تعزز العيوب في تنشيط الخلايا الليفية والوظيفة الأورام والمرض. على سبيل المثال، تنشيط الأورام الليفية غير المناسبة يؤدي عادة إلى تشكيل التليف، الناجمة عن الترسيب المعزز لمكونات ECM الزائدة في الأنسجة المحيطة بها. كما تحافظ الخلايا الليفية على الكثير من السلامة الهيكلية للجسم، والتليف يعزز الأمراض التي تؤثر على العديد من الأنسجة والأعضاء، بما في ذلك التليف الرئوي مجهول السبب، والتصلب الجهازي، وتليف الكبد والتليف القلبي15. الأورام الليفية تلعب أيضا دورا حاسما في السرطان16. الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) هي الخلايا غير الخبيثة الأكثر وفرة في البيئة الدقيقة للعديد من الأورام. وقد ثبت CAFs لتعزيز انتشار الورم، والتقدم والمقاومة العلاجية عن طريق تحوير تصلب الأنسجة، وإنتاج السيتوكين المحلية ووظيفة المناعة16.
توفر ثقافات الخلايا الأولية للباحثين نماذج قابلة للزراعة وراثياً لتحديد والتخفيف من عيوب الخلايا الصباغية والأورام الليفية التي تؤدي إلى المرض. ومع ذلك، فإن الأساليب الحالية لإنشاء الثقافات الخلايا الصباغية تستغرق وقتا طويلا وصعبة من الناحية الفنية. الحاجة إلى التجريب والفصل الدقيق بين البشرة والأدمة يساهم في تقلب في الغلة التجريبية ويجعل من الصعب إجراء تجارب واسعة النطاق. وعلاوة على ذلك، تفتقر حاليا في هذا المجال بروتوكولات لعزل الخلايا الصباغية والخلايا الليفية في وقت واحد من الجلد كله.
لقد قمنا بتطوير طريقة للحد من خطوات المعالجة والتباين والوقت اللازم لإنشاء الثقافات الميلانية والليفية من نفس عينة الجلد بأكملها. باستخدام طريقة التجانس الميكانيكية تليها الهضم وجيزة، استراتيجيتنا يقلل بشكل كبير من كمية الوقت العملي اللازم لعزل الخلايا الصباغية الأولية مع تمكين العزلة الليفية المتزامنة. زيادة سرعة وكفاءة واتساق هذا البروتوكول، جنبا إلى جنب مع القدرة على عزل الخلايا الصباغية من الفئران القديمة 0-4 أيام، ويوفر للباحثين المرونة لإجراء مجموعة أوسع من التجارب مما كان ممكنا في السابق.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أدت الثقافة في المختبر من الخلايا الصباغية الأولية والخلايا الليفية إلى تقدم كبير في فهمنا لبيولوجيا الجلد والمرض. هذا البروتوكول يحسن على طرق عزل الخلايا الصباغية السابقة عن طريق الحد من الوقت والدهاء التقنية اللازمة لتوليد الثقافات الخلايا الصباغية متسقة مع السماح لعزل في وقت واح?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون مؤسسة دامون رونيون (جائزة الابتكار #38-16 إلى C.E.B.) وبيلوتونيا (B.M.M.) على الدعم المالي. نحن ممتنون لسي هاينز و C. فورمسبيشر اللذين قدما تعليقات لتحسين نص المخطوطة. استفاد هذا العمل من الموارد المشتركة التحليلية للستومية في مركز ولاية أوهايو، والتي يدعمها NIH P30 CA016058.
Materials
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
References
- Rittie, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communucation and Signal. 10 (2), 103-120 (2016).
- Romanovsky, A. A. Skin temperature: its role in thermoregulation. Acta Physiologica (Oxf). 210 (3), 498-507 (2014).
- Holick, M. F., Smith, E., Pincus, S. Skin as the site of vitamin D synthesis and target tissue for 1,25-dihydroxyvitamin D3. Use of calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) for treatment of psoriasis. Archives of Dermatology. 123 (12), 1677-1683 (1987).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. Physiological factors that regulate skin pigmentation. Biofactors. 35 (2), 193-199 (2009).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. Melanocytes and their diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (5), (2014).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Thody, A. J., et al. Pheomelanin as well as eumelanin is present in human epidermis. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (2), 340-344 (1991).
- Swope, V. B., Abdel-Malek, Z. A. MC1R: Front and Center in the Bright Side of Dark Eumelanin and DNA Repair. International Journal of Molecular Science. 19 (9), (2018).
- Barsh, G. S. What controls variation in human skin color. PLoS biology. 1 (1), 27 (2003).
- Abdel-Malek, Z., et al. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation. Pigment Cell Research. 13, 156-162 (2000).
- Gronskov, K., Ek, J., Brondum-Nielsen, K. Oculocutaneous albinism. Orphanet Journal of Rare Diseases. 2, 43 (2007).
- Kwon, S. H., Hwang, Y. J., Lee, S. K., Park, K. C. Heterogeneous Pathology of Melasma and Its Clinical Implications. International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).
- D’Orazio, J., Jarrett, S., Amaro-Ortiz, A., Scott, T. UV radiation and the skin. International Journal of Molecular Science. 14 (6), 12222-12248 (2013).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Dickson, M. A., et al. Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1436-1447 (2000).
