Geração rápida de culturas de melanócitos e fibroblastos de Murina primária
Summary
Este protocolo esboça um método rápido para gerar simultaneamente culturas do melanócito e do fibroblasto da pele de 0-4 ratos velhos do dia. Estas culturas primárias podem ser mantidas e manipuladas in vitro para estudar uma variedade de processos fisiologicamente relevantes, incluindo biologia celular da pele, pigmentação, cicatrização de feridas e melanoma.
Abstract
Os defeitos na função do fibroblasto ou do melanócito são associados com as doenças de pele, incluindo a função pobre da barreira, a cura defeituosa da ferida, defeitos da pigmentação e cancro. Vital para a compreensão e melhora dessas doenças são experimentos em fibroblastos primários e culturas de melanócitos. Não obstante, os protocolos atuais para a isolação do melanócito exigem que as camadas epidérmicas e dérmicas da pele estejam tripsinizadas e desassociaram manualmente. Este processo é demorado, tecnicamente desafiador e contribui para rendimentos inconsistentes. Além disso, os métodos para gerar simultaneamente culturas puras do fibroblasto da mesma amostra do tecido não estão prontamente-disponíveis. Aqui, nós descrevemos um protocolo melhorado para isolando melanócitos e fibroblastos da pele dos ratos em dias pós-natal 0-4. Neste protocolo, a pele inteira é homogeneizada mecanicamente usando um interruptor inversor do tecido e então digerido momentaneamente com o colagenase e o Trypsin. As populações da pilha são isoladas então com o chapeamento seletivo seguido pelo tratamento G418. Este procedimento resulta em rendimentos consistentes de melanócitos e fibroblastos de um único rato em menos de 90 min. Este protocolo também é facilmente escalável, permitindo que os pesquisadores processem grandes coortes de animais sem um aumento significativo no tempo hands-on. Nós mostramos através das avaliações cytometric do do fluxo que as culturas estabelecidas usando este protocolo são enriquecidas altamente para melanócitos ou fibroblasto.
Introduction
A pele de mamíferos é um órgão multicamada que protege o corpo de patógenos estrangeiros e irradiação ultravioleta (UVR). A pele também desempenha um papel crítico em processos homeostáticos como cicatrização de feridas, regulação da temperatura e produção de vitamina D1,2,3. A pele de mamíferos consiste em três tipos principais da pilha: melanócitos, fibroblasto e keratinocytes. Estes tipos de células povoam diferentes camadas da pele, com queratinócitos que compõem a epiderme, fibroblastos residentes na derme e melanócitos localizando a junção epidérmica-dérmica e folículos pilosos4. Aqui, nós detalham um procedimento simples que permita a geração simultânea de culturas primárias do melanócito e do fibroblasto da pele murino.
Os melanócitos são células produtoras de pigmentos encontradas em muitos locais em todo o corpo humano, incluindo a epiderme basal, íris, cóclea, cérebro e folículos pilosos5. A função primária dos melanócitos é gerar e secretar vesículas contendo melanina,denominadas melanosomas5,6. Os melanosomas contêm duas classes principais da melanina: eumelanina marrom/preto e feomelanina amarelo/vermelho6,7. Os processos bioquímicos dentro do melanócito regulam a abundância relativa de cada espécie da melanina e ajudam a determinar a cor do cabelo, da pele e do olho8,9. A melanina também serve para absorver a UVR e proteger os tecidos expostos ao sol da mutagenese10.
A disfunção de melanócitos pode causar defeitos pigmentares e aumentar a susceptibilidade do cancro da pele. Por exemplo, os remendos da pele Hyper-pigmented característicos do melasma são o resultado da superprodução focal da melanina, visto que as mutações genéticas do germline que comprometem genes envolvidos na síntese da melanina conduzem ao albinismo11,12 . O conhecimento íntimo da biologia do melanócito é exigido para desenvolver as estratégias que corrijam tais defeitos pigmentários e melhoram finalmente o bem-estar psicossocial dos indivíduos afligidos com estas doenças. Os déficits na produção de melanina e/ou a síntese preferencial de feomelanina também estão associados ao aumento do risco de câncer de pele10. Acredita-se que esse risco resulte da redução da proteção UVR6,13. Assim, métodos para melhorar ou restaurar a produção de eumelanina em melanócitos podem reduzir a incidência de câncer de pele nessas populações.
Os fibroblastos mesenquimais estabelecem o tecido conjuntivo e o suporte estrutural para todos os órgãos do corpo, incluindo a camada dérmica da pele14. A excreção de proteínas como colágeno, elastina, laminina e fibronectina permitem que os fibroblastos formem a matriz extracelular (ECM) que é essencial para a integridade tecidual1,14. Os fibroblastos também desempenham papéis essenciais em processos como cicatrização de feridas, inflamação, angiogênese e formação/progressão do câncer1,15,16.
Similar aos melanócitos, os defeitos na ativação e na função do fibroblasto podem promover o tumorigênese e a doença. Por exemplo, a ativação inadequada do fibroblasto conduz geralmente à formação da fibrose, resultando da deposição aumentada de componentes excedentes do ECM no tecido circunvizinho. Como os fibroblastos mantêm grande parte da integridade estrutural do corpo, a fibrose promove doenças que afetam inúmeros tecidos e órgãos, incluindo fibrose pulmonar idiopática, esclerose sistêmica, cirrose hepática e Fibrose cardíaca15. Os fibroblastos também desempenham um papel crítico no câncer16. Os fibroblastos associados ao câncer (CAFs) são as células não malignas mais abundantes no microambiente de muitos tumores. Os CAFs demonstraram promover a proliferação tumoral, a progressão e a resistência terapêutica, modulando a rigidez tecidual, a produção local de citocinas e a função imune16.
As culturas de células primárias fornecem aos pesquisadores modelos geneticamente tratável para identificar e mitigar os defeitos de melanócitos e fibroblastos que levam à doença. No entanto, os métodos atuais para estabelecer culturas de melanócitos são demorados e tecnicamente desafiadores. A necessidade de tripsinização e a separação delicada da epiderme e da derma contribuem à variabilidade no rendimento experimental e fazem difícil executar experimentos em grande escala. Além disso, os protocolos para isolar simultaneamente os melanócitos e os fibroblasto da pele inteira estão faltando atualmente no campo.
Desenvolvemos um método para reduzir as etapas de processamento, a variabilidade e o tempo necessário para estabelecer culturas de melanócitos e fibroblastos da mesma amostra de pele inteira. Usando um método mecânico da homogeneização seguido por uma digestão breve, nossa estratégia diminui significativamente a quantidade de tempo hands-on exigido para isolar melanócitos preliminares ao permitir o isolamento simultâneo do fibroblasto. O aumento da velocidade, eficiência e consistência deste protocolo, em combinação com a capacidade de isolar melanócitos de camundongos de 0-4 dias de idade, fornece aos pesquisadores a flexibilidade para realizar uma ampla gama de experimentos do que antes possível.
Protocol
Representative Results
Discussion
A cultura in vitro de melanócitos primários e fibroblastos levou a avanços significativos na nossa compreensão da biologia da pele e da doença. Este protocolo melhora em cima dos métodos anteriores da isolação do melanócito reduzindo o tempo e o savvy técnico necessários para gerar culturas consistentes do melanócito ao permitir o isolamento simultâneo de fibroblastos da pele. Um romance, elemento de economia de tempo deste procedimento é que a derme e epiderme não precisam ser separadas. Em vez disso, as …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem à Fundação Damon Runyon (prêmio de inovação #38-16 a C.E.B.) e Pelotonia (B.M.M.) para apoio financeiro. Agradecemos a C. Haines e a C. Wormsbaecher que forneceram comentários para melhorar o texto do manuscrito. Este trabalho beneficiou do recurso compartilhado de citometria analítica do centro de câncer do estado de Ohio, que é apoiado pela NIH p30 CA016058.
Materials
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
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