Generazione rapida delle culture primarie di Murine Melanocite e Fibroblast
Summary
Questo protocollo delinea un metodo rapido per generare simultaneamente colture di melanociti e fibroblasti dalla pelle di topi di 0-4 giorni. Queste colture primarie possono essere mantenute e manipolate in vitro per studiare una varietà di processi fisiologicamente rilevanti, tra cui biologia cellulare della pelle, pigmentazione, guarigione delle ferite e melanoma.
Abstract
I difetti nella funzione fibroblasta o melanocite sono associati a malattie della pelle, tra cui scarsa funzione di barriera, guarigione difettosa delle ferite, difetti di pigmentazione e cancro. Vitali per la comprensione e il miglioramento di queste malattie sono esperimenti nelle colture primarie di fibroblasto e melanociti. Tuttavia, i protocolli attuali per l’isolamento del melanocite richiedono che gli strati epidermici e dermici della pelle siano trypsinizzati e dissociati manualmente. Questo processo richiede molto tempo, è tecnicamente impegnativo e contribuisce a rendimenti incoerenti. Inoltre, i metodi per generare simultaneamente colture fibroblaste pure dallo stesso campione di tessuto non sono prontamente disponibili. Qui, descriviamo un protocollo migliorato per isolare melanociti e fibroblasti dalla pelle dei topi nei giorni postnatali 0-4. In questo protocollo, tutta la pelle viene omogeneizzata meccanicamente utilizzando un chopper di tessuto e poi brevemente digerita con collagenae e trypsina. Le popolazioni cellulari vengono poi isolate attraverso la placcatura selettiva seguita dal trattamento G418. Questa procedura si traduce in rendimenti costante di melanocite e fibroblasto da un singolo topo in meno di 90 min. Questo protocollo è anche facilmente scalabile, consentendo ai ricercatori di elaborare grandi coorti di animali senza un aumento significativo dei tempi pratici. Dimostriamo attraverso le valutazioni citometriche di flusso che le colture stabilite utilizzando questo protocollo sono altamente arricchite per melanociti o fibroblasti.
Introduction
La pelle di mammifero è un organo multistrato che protegge il corpo da patogeni estranei e irradiazione ultravioletta (UVR). La pelle svolge anche un ruolo fondamentale nei processi omeostatici come la guarigione delle ferite, la regolazione della temperatura e la produzione di vitamina D1,2,3. La pelle di mammaliana è costituita da tre tipi principali di cellule: melanociti, fibroblasti e cheratinociti. Questi tipi di cellule popolano diversi strati della pelle, con cheratinociti che compongono l’epidermide, fibroblasti che risiedono nel derma e melanociti che si localizzano alla giunzione epidermal-dermica e follicoli piliferi4. Qui, dettagliamo una semplice procedura che consente la generazione simultanea di colture primarie di melanociti e fibroblasti dalla pelle murina.
I melanociti sono cellule che producono pigmenti che si trovano in molte posizioni in tutto il corpo umano, tra cui l’epidermide basale, l’iride, la coclea, il cervello e i follicoli piliferi5. La funzione principale dei melanociti è quella di generare e secernere vesciche contenenti melanina chiamate melanosomi5,6. I melanosomi contengono due classi principali di melanina: eumelanina marrone/nera e feomelanina giallo/rosso6,7. I processi biochimici all’interno del melanocito regolano l’abbondanza relativa di ogni specie di melanina e aiutano a determinare il colore dei capelli, della pelle e degli occhi8,9. La melanina serve anche ad assorbire UVR e proteggere i tessuti esposti al sole dalla mutagenesi10.
La disfunzione melanocite può causare difetti pigmentari e aumentare la suscettibilità al cancro della pelle. Ad esempio, le macchie di pelle iperpigmentate caratteristiche del melasma sono il risultato della sovrapproduzione di melanina focale, mentre le mutazioni genetiche germinali che compromettono i geni coinvolti nella sintesi della melanina portano all’albinismo11,12 . La conoscenza intima della biologia del melanocite è necessaria per sviluppare strategie che correggano tali difetti pigmentari e, in ultima analisi, migliorino il benessere psicosociale degli individui afflitti da queste malattie. I deficit nella produzione di melanina e/o la sintesi preferenziale della feomelanina sono anche associati con un aumento del rischio di cancro della pelle10. Si ritiene che questo rischio risulti deriva dalla protezione UVR ridotta6,13. Così, metodi per migliorare o ripristinare la produzione di eumelanina in melanociti possono ridurre l’incidenza del cancro della pelle in queste popolazioni.
I fibroblasti mesenchymi stabiliscono il tessuto connettivo e il supporto strutturale per tutti gli organi del corpo, compreso lo strato dermico della pelle14. L’escrezione di proteine come collagene, elastina, laminina e fibronectina consentono ai fibroblasti di formare la matrice extracellulare (ECM) che è essenziale per l’integrità del tessuto1,14. I fibroblasti svolgono anche un ruolo essenziale in processi come la guarigione delle ferite, l’infiammazione, l’angiogenesi e la formazione/progressione del cancro1,15,16.
Simile ai melanociti, i difetti nell’attivazione e nella funzione del fibroblasto possono promuovere la tumorigenesi e la malattia. Ad esempio, l’attivazione inappropriata del fibroblasto porta comunemente alla formazione di fibrosi, risultante dalla maggiore deposizione di componenti ECM in eccesso nel tessuto circostante. Come fibroblasti mantengono gran parte dell’integrità strutturale del corpo, fibrosi promuove malattie che colpiscono numerosi tessuti e organi, tra cui fibrosi polmonare idiopatica, sclerosi sistemica, cirrosi epatica e fibrosi cardiaca15. I fibroblasti svolgono anche un ruolo fondamentale nel cancro16. I fibroblasti associati al cancro (CAF) sono le cellule non maligne più abbondanti nel microambiente di molti tumori. I CAF hanno dimostrato di promuovere la proliferazione tumorale, la progressione e la resistenza terapeutica modulando la rigidità dei tessuti, la produzione di citochine locali e la funzione immunitaria16.
Le colture cellulari primarie forniscono ai ricercatori modelli geneticamente trattabili per identificare e mitigare i difetti del melanocito e del fibroblasto che portano alla malattia. Tuttavia, gli attuali metodi per stabilire le culture melanocite richiedono molto tempo e sono tecnicamente impegnativi. La necessità di provare e la delicata separazione dell’epidermide e del dermide contribuisce alla variabilità nella resa sperimentale e rende difficile eseguire esperimenti su larga scala. Inoltre, attualmente mancano protocolli per isolare simultaneamente melanociti e fibroblasti da tutta la pelle.
Abbiamo sviluppato un metodo per ridurre le fasi di lavorazione, la variabilità e il tempo necessario per stabilire le colture di melanociti e fibroblasti dallo stesso campione di pelle intero. Utilizzando un metodo di omogeneizzazione meccanica seguito da una breve digestione, la nostra strategia riduce significativamente la quantità di tempo pratico necessario per isolare i melanociti primari consentendo l’isolamento simultaneo del fibroblasto. L’aumento della velocità, dell’efficienza e della coerenza di questo protocollo, in combinazione con la capacità di isolare i melanociti dai topi vecchi di 0-4 giorni, offre ai ricercatori la flessibilità necessaria per eseguire una gamma più ampia di esperimenti rispetto a prima possibile.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cultura in vitro dei melanociti primari e dei fibroblasti ha portato a significativi progressi nella nostra comprensione della biologia e della malattia della pelle. Questo protocollo migliora i precedenti metodi di isolamento dei melanociti riducendo il tempo e l’esperto tecnico necessari per generare colture di melanociti coerenti, consentendo al contempo l’isolamento simultaneo dei fibroblasti cutanei. Un nuovo elemento che consente di risparmiare tempo di questa procedura è che il dermide e l’epidermide non hanno…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano la Damon Runyon Foundation (Innovation Award #38-16 a C.E.B.) e Pelotonia (B.M.M.) per il sostegno finanziario. Siamo grati a C. Haines e C. Wormsbaecher che hanno fornito commenti per migliorare il testo del manoscritto. Questo lavoro ha beneficiato della risorsa condivisa Cytometry analitica dell’Ohio State Comprehensive Cancer Center, supportata da NIH P30 CA016058.
Materials
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
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