初级毛质素黑色素细胞和纤维细胞培养的快速生成
Summary
该协议概述了一种快速方法,从0-4天大小鼠的皮肤中同时产生黑色素细胞和成纤维细胞培养物。这些主要培养物可以在体外维护和操作,以研究各种生理相关过程,包括皮肤细胞生物学、色素沉着、伤口愈合和黑色素瘤。
Abstract
成纤维细胞或黑色素细胞功能的缺陷与皮肤病有关,包括屏障功能差、伤口愈合缺陷、色素沉着缺陷和癌症。理解和改善这些疾病的关键是在原发性成纤维细胞和黑色素细胞培养物中的实验。然而,目前的黑色素细胞分离协议要求皮肤的表皮和皮肤层被试穿和手动解除关联。这个过程非常耗时,技术上具有挑战性,并且会导致产量不一致。此外,从同一组织样本同时生成纯成纤维细胞培养的方法也不容易获得。在这里,我们描述了在产后0-4日从小鼠皮肤上分离黑色素细胞和成纤维细胞的改进方案。在此协议中,使用组织切碎器对整个皮肤进行机械均质化,然后用胶原酶和胰蛋白酶短暂消化。然后通过选择性电镀分离细胞群,然后进行G418治疗。此过程在不到 90 分钟内从单个小鼠获得一致的黑色细胞和成纤维细胞。该协议也易于扩展,使研究人员能够处理大量动物,而无需显著增加动手时间。我们通过流式细胞测量表明,使用该协议建立的培养物对黑色素细胞或成纤维细胞具有很高的丰富性。
Introduction
哺乳动物皮肤是一种多层器官,保护身体免受外来病原体和紫外线照射(UVR)。皮肤在伤口愈合、温度调节和维生素D生产等静温过程中也起着关键作用。1,2,3。哺乳动物皮肤由三种主要细胞类型组成:黑色素细胞、成纤维细胞和角蛋白细胞。这些细胞类型填充皮肤的不同层,角蛋白细胞组成表皮,成纤维细胞驻留在真皮和黑色素细胞局部到表皮-皮肤结和毛囊4。在这里,我们详细介绍了一个简单的过程,使主素黑色素细胞和成纤维细胞培养物从鼠皮并发生成。
黑色素细胞是色素生成细胞,存在于人体的许多地方,包括基底表皮、虹膜、耳蜗、大脑和毛囊5。黑色素细胞的主要功能是生成和分泌含黑色素的囊泡,称为黑色素体5,6。黑色素包含黑色素的两大类:棕色/黑色欧美兰素和黄色/红色五甲素6,7。黑色素细胞内的生化过程调节每个黑色素物种的相对丰度,并帮助确定头发、皮肤和眼睛的颜色8,9。梅拉宁也用于吸收UVR和保护阳光暴露组织免受诱变10。
黑色素细胞功能障碍可引起色素缺陷,增加皮肤癌易感性。例如,黑色素的超色素皮肤斑块是焦点黑色素过度生产的结果,而影响黑色素合成基因的生殖系基因突变导致白化病11,12.黑素细胞生物学的深入了解需要制定策略,以纠正这些色素缺陷,并最终改善患有这些疾病的个人的心理社会福祉。黑色素生产和/或优均合成的蛋素也与皮肤癌风险增加10相关。这种风险被认为是由于减少的UVR保护6,13。因此,提高或恢复黑色素细胞中欧美兰素生产的方法可以减少这些人群皮肤癌的发病率。
中成纤维细胞建立结缔组织和结构支持的所有身体器官,包括皮肤的皮肤层14。蛋白质的排泄,如胶原蛋白,艾氏氨酸,拉米宁和纤维蛋白使成纤维细胞形成细胞外基质(ECM),这是组织完整性1,14。成纤维细胞在伤口愈合、炎症、血管生成和癌症形成/进展1、15、16等过程中也起着至关重要的作用。
与黑色素细胞类似,成纤维细胞活化和功能的缺陷可以促进肿瘤的产生和疾病。例如,不适当的成纤维细胞活化通常会导致纤维化的形成,因为多余的ECM成分沉积到周围组织。由于成纤维细胞保持身体的许多结构完整性,纤维化促进影响许多组织和器官的疾病,包括特发性肺纤维化,全身硬化症,肝硬化和心脏纤维化15。成纤维细胞在癌症16中也起着关键作用。癌症相关成纤维细胞(CAFs)是许多肿瘤微环境中最丰富的非恶性细胞。CAF已被证明通过调节组织刚度、局部细胞因子产生和免疫功能16来促进肿瘤增殖、进展和治疗阻力。
初级细胞培养为研究人员提供遗传可处理的模型,以识别和缓解导致疾病的黑色素细胞和成纤维细胞缺陷。然而,目前建立黑色素细胞培养的方法既费时又在技术上具有挑战性。表皮和真皮的试穿和精细分离的需要导致实验产量的变异性,使进行大规模实验变得困难。此外,目前该领域还缺乏同时从整个皮肤分离黑色素细胞和成纤维细胞的协议。
我们已经开发出一种方法,以减少处理步骤,变异性和时间,建立黑色素细胞和成纤维细胞培养从相同的整个皮肤样本。使用机械均质方法,然后进行短暂的消化,我们的策略可显著减少分离原发性黑色素细胞所需的动手时间,同时实现并发成纤维细胞分离。该协议的速度、效率和一致性的提高,加上从0-4天大小鼠中分离黑色素细胞的能力,为研究人员提供了灵活性,可以进行比以前更广泛的实验。
Protocol
Representative Results
Discussion
原发性黑色素细胞和成纤维细胞的体外培养使我们对皮肤生物学和疾病的理解有了重大进步。该协议通过减少生成一致的黑色细胞培养物所需的时间和技术知识,同时允许同时分离皮肤成纤维细胞,改进了先前的黑色素细胞分离方法。这个过程的一个新颖的、节省时间的要素是真皮和表皮不需要分离。相反,使用机械组织切碎器的一致斩力和粒度以及选择性介质和电镀技术来分离皮肤细胞。通过降低?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢达蒙·鲁尼恩基金会(创新奖#38-16授予C.E.B.)和佩洛托尼亚(B.M.M.)的财政支持。我们感谢C.海恩斯和C.沃姆巴彻,他们提出了改进稿件的评论。这项工作得益于俄亥俄州综合癌症中心的分析细胞学共享资源,该资源由NIH P30 CA016058支持。
Materials
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
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