Generación rápida de cultivos primarios de melanocitos muritonos y fibroblastos
Summary
Este protocolo describe un método rápido para generar simultáneamente cultivos de melanocitos y fibroblastos a partir de la piel de ratones de 0-4 días de edad. Estos cultivos primarios pueden ser mantenidos y manipulados in vitro para estudiar una variedad de procesos fisiológicamente relevantes, incluyendo biología celular de la piel, pigmentación, cicatrización de heridas y melanoma.
Abstract
Los defectos en la función de fibroblastos o melanocitos se asocian con enfermedades de la piel, incluyendo la función de barrera deficiente, cicatrización de heridas defectuosas, defectos de pigmentación y cáncer. Vital para la comprensión y la mejora de estas enfermedades son experimentos en cultivos primarios de fibroblastos y melanocitos. Sin embargo, los protocolos actuales para el aislamiento de melanocitos requieren que las capas epidérmicas y dérmicas de la piel se trippsinizan y se desvinculen manualmente. Este proceso consume mucho tiempo, técnicamente desafiante y contribuye a rendimientos inconsistentes. Además, los métodos para generar simultáneamente cultivos de fibroblastos puros a partir de la misma muestra de tejido no están fácilmente disponibles. Aquí, describimos un protocolo mejorado para aislar melanocitos y fibroblastos de la piel de los ratones en los días postnatales 0-4. En este protocolo, toda la piel se homogeneiza mecánicamente usando un helicóptero de tejido y luego se digiere brevemente con colagenasa y trippsina. Las poblaciones celulares se aíslan a través de un revestimiento selectivo seguido del tratamiento con G418. Este procedimiento da como resultado rendimientos constantes de melanocitos y fibroblastos de un solo ratón en menos de 90 minutos. Este protocolo también es fácilmente escalable, lo que permite a los investigadores procesar grandes cohortes de animales sin un aumento significativo en el tiempo de práctica. Mostramos a través de evaluaciones citométricas de flujo que los cultivos establecidos con este protocolo están altamente enriquecidos para melanocitos o fibroblastos.
Introduction
La piel de mamífero es un órgano multicapa que protege el cuerpo de patógenos extraños e irradiación ultravioleta (UVR). La piel también juega un papel crítico en los procesos homeostáticos como la cicatrización de heridas, la regulación de la temperatura y la producción de vitamina D1,2,3. La piel de mamífero consta de tres tipos principales de células: melanocitos, fibroblastos y queratinocitos. Estos tipos celulares pueblan diferentes capas de la piel, con queratinocitos que componen la epidermis, fibroblastos que residen en la dermis ymelanocitos localizando a la unión epidérmica-dérmica y folículos pilosos 4. Aquí, detallamos un procedimiento simple que permite la generación simultánea de cultivos primarios de melanocitos y fibroblastos a partir de la piel murina.
Los melanocitos son células productoras de pigmentos que se encuentran en muchos lugares del cuerpo humano,incluyendo la epidermis basal, iris, cócleara, cerebro y folículos pilosos 5. La función principal de los melanocitos es generar y secretar vesículas que contienen melanina llamadas melanosomas5,6. Los melanosomas contienen dos clases principales de melanina: eumelanina marrón/negra y feomelanina amarilla/roja6,7. Los procesos bioquímicos dentro del melancito regulan la abundancia relativa de cadaespecie de melanina y ayudan a determinar el cabello, la piel y los ojos de color 8,9. La melanina también sirve para absorber la UVR y proteger los tejidos expuestos al sol de la mutagénesis10.
La disfunción del melanocitos puede causar defectos pigmentarios y aumentar la susceptibilidad al cáncer de piel. Por ejemplo, los parches de piel hiperpigmentados característicos del melasma son el resultado de la sobreproducción focal de melanina, mientras que las mutaciones genéticas germinales que comprometen los genes implicados en la síntesis de melanina conducen al albinismo11,12 . Se requiere un conocimiento íntimo de la biología de los melanocitos para desarrollar estrategias que corrijan tales defectos pigmentarios y, en última instancia, mejoren el bienestar psicosocial de las personas afectadas por estas enfermedades. Déficits en la producción de melanina y / o la síntesis preferencial de feomelanina también se asocian con el aumento del riesgo de cáncer de piel10. Se cree que este riesgo es el resultado de una reducción de la protección UVR6,13. Por lo tanto, métodos para mejorar o restaurar la producción de eumelanina en melanocitos pueden reducir la incidencia de cáncer de piel en estas poblaciones.
Los fibroblastos mesenquimales establecen el tejido conectivo y el soporte estructural para todos los órganos del cuerpo, incluida la capa dérmica de la piel14. La excreción de proteínas como el colágeno, la elastina, laminina y fibronectina permiten que losfibroblastos formen la matriz extracelular (ECM) que es esencial para la integridad del tejido 1,14. Los fibroblastos también desempeñan un papel esencial en procesos como la cicatrización de heridas, inflamación, angiogénesis y formación/progresión del cáncer1,15,16.
Al igual que los melanocitos, los defectos en la activación y función de los fibroblastos pueden promover la tumorigenesis y la enfermedad. Por ejemplo, la activación inadecuada de fibroblastos comúnmente conduce a la formación de fibrosis, como resultado de la mayor deposición de componentes de ECM en exceso en el tejido circundante. Como los fibroblastos mantienen gran parte de la integridad estructural del cuerpo, la fibrosis promueve enfermedades que afectan a numerosos tejidos y órganos, incluyendo fibrosis pulmonar idiopática, esclerosis sistémica, cirrosis hepática y fibrosis cardíaca15. Los fibroblastos también desempeñan un papel crítico en el cáncer16. Los fibroblastos asociados al cáncer (CAC) son las células no malignas más abundantes en el microambiente de muchos tumores. Se ha demostrado que los CAF promueven la proliferación tumoral, la progresión y la resistencia terapéutica mediante la modulación de la rigidez tisular, la producción local de citoquinas y la función inmune16.
Los cultivos celulares primarios proporcionan a los investigadores modelos genéticamente manejables para identificar y mitigar los defectos de melanocitos y fibroblastos que conducen a la enfermedad. Sin embargo, los métodos actuales para establecer cultivos de melanocitos consumen mucho tiempo y son técnicamente desafiantes. La necesidad de tripinización y separación delicada de la epidermis y la dermis contribuye a la variabilidad en el rendimiento experimental y dificulta la realización de experimentos a gran escala. Además, actualmente faltan protocolos para aislar simultáneamente melanocitos y fibroblastos de toda la piel en el campo.
Hemos desarrollado un método para reducir los pasos de procesamiento, la variabilidad y el tiempo necesario para establecer cultivos de melanocitos y fibroblastos a partir de la misma muestra de piel entera. Utilizando un método de homogeneización mecánica seguido de una breve digestión, nuestra estrategia disminuye significativamente la cantidad de tiempo práctico necesario para aislar los melanocitos primarios al tiempo que permite el aislamiento simultáneo de fibroblastos. El aumento de la velocidad, eficiencia y consistencia de este protocolo, en combinación con la capacidad de aislar melanocitos de ratones de 0-4 días de edad, proporciona a los investigadores la flexibilidad para realizar una gama más amplia de experimentos de lo que antes era posible.
Protocol
Representative Results
Discussion
El cultivo in vitro de melanocitos primarios y fibroblastos ha llevado a avances significativos en nuestra comprensión de la biología y la enfermedad de la piel. Este protocolo mejora los métodos previos de aislamiento de melanocitos al reducir el tiempo y los conocimientos técnicos necesarios para generar cultivos de melanocitos consistentes, al tiempo que permite el aislamiento simultáneo de fibroblastos cutáneos. Un elemento novedoso que ahorra tiempo de este procedimiento es que la dermis y la epidermis no nece…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el apoyo financiero a la Fundación Damon Runyon (Premio a la Innovación #38-16 a C.E.B.) y a Pelotonia (B.M.M.). Agradecemos a C. Haines y C. Wormsbaecher que proporcionaron comentarios para mejorar el texto del manuscrito. Este trabajo se benefició del Recurso Compartido de Citometría Analítica del Centro Integral del Cáncer de Ohio, que es apoyado por NIH P30 CA016058.
Materials
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
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