Cibler les agrégats alpha synuclein dans les fibres nerveuses périphériques cutanées par l'évaluation de l'immunofluorescence flottante
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour un test d’immunofluorescence indirecte flottant sur les sections de biopsie de peau qui permet l’identification des variantes spécifiques de conformation de la maladie de la synuclein alpha impliquée dans la maladie de Parkinson et les protéines multiples du système nerveux périphérique.
Abstract
À ce jour, pour la plupart des maladies neurodégénératives, seul un diagnostic histopathologique post-mortem définitif est disponible. Pour la maladie de Parkinson (PD), le diagnostic repose toujours seulement sur des signes cliniques de la participation motrice qui apparaissent plus tard dans le cours de la maladie, quand la plupart des neurones dopaminergiques sont déjà perdus. Par conséquent, il y a un fort besoin d’un biomarqueur qui puisse identifier les patients au début de la maladie ou au risque de le développer. Au cours des dernières années, la biopsie de la peau s’est avérée être un excellent outil de recherche et de diagnostic pour les maladies nerveuses périphériques telles que la neuropathie des petites fibres. Fait intéressant, une petite neuropathie de fibre et des dépôts neuronaux alpha synucléines ont été montrés par biopsie de peau dans les patients de. En effet, la biopsie de la peau a le grand avantage d’être une procédure facilement accessible, peu invasive et indolore qui permet l’analyse du tissu nerveux périphérique enclin à la pathologie. En outre, la possibilité de répéter la biopsie de peau au cours du suivi du même patient permet d’étudier la corrélation longitudinale avec la progression de la maladie. Nous avons mis en place un protocole fiable normalisé pour étudier la présence des agrégats de Syn dans les fibres nerveuses de peau du patient de. Ce protocole implique peu d’étapes courtes de fixation, une section cryotome et puis une double coloration d’immunofluorescence flottante avec deux anticorps spécifiques : anti-produit de gène de protéine 9.5 (PGP9.5) pour marquer les fibres cutanées de nerf et anti 5G4 pour détecter Agrégats Syn. Il s’agit d’un protocole polyvalent, sensible et facile à exécuter qui peut également être appliqué pour cibler d’autres protéines d’intérêt dans les nerfs de la peau. La capacité de marquer les agrégats de Syn est un autre pas en avant à l’utilisation de la biopsie de peau comme outil pour établir un diagnostic histopathologique pré-mortem de.
Introduction
La biopsie de la peau a acquis une grande importance en tant qu’outil de diagnostic et de recherche dans le domaine des troubles neurologiques1. En effet, l’épiderme et le derme contiennent d’abondantes fibres nerveuses sensorielles somatiques (myélinisés et non myélinistielles), des terminaisons nerveuses sans nociceptive, des récepteurs sensoriels et une innervation autonome des glandes sudoripares, des vaisseaux, des glandes sébacées et des pilorum d’arrector musculaires. 2.
Au milieu du XXe siècle, la configuration de l’immunohistochimie de l’anticorps PGP9.5 a permis l’évidence d’une innervation étendue de la peau humaine de mammifères d’épiderme3. PGP9.5 est un hydrolase carboxyl-terminal également réparti le long des axones du système nerveux central et périphérique (PNS). La disponibilité de cet anticorps a permis non seulement de clarifier la morphologie et l’anatomie de PNS dans la peau, mais a également mis en œuvre l’étude des maladies qui lui sont associées3,4. La biopsie de peau a contribué à définir une nouvelle entité clinique : la neuropathie de petite fibre. Plusieurs groupes internationaux ont démontré l’association entre la perte des fibres nerveuses intraépidermiques et des symptômes/signes de la neuropathie de petite fibre5 par l’analyse de biopsie de peau et ont fourni des protocoles normalisés pour la morphométrie de nerf aussi bien que valeurs de référence normatives à utiliser dans la pratique clinique6,7,8.
Récemment, une grande quantité de preuves a montré que les maladies neurodégénératives, caractérisées par des accumulations de protéines mal repliées dans le système nerveux central, sont des pathologies multi-systèmes9. En effet, la DP se caractérise par une accumulation de Syn dans le neurone dopaminergique de la substantia nigra, mais il a été démontré que le Syn et sa forme pathologique, phosphorylée Syn (P-Syn), pouvaient être détectés également dans les tissus périphériques. La muqueuse gastro-intestinale10, glandes salivaires11, fibres autonomes de la peau entourant les glandes sudoripares et les muscles pilomoteurs12,13,14, montrent l’immunoréactivité aux formes pathogènes de ‘Syn, en conformément à l’hypothèse de Braak qui postulent intrigantement que la pathologie de Syn peut commencer dans PNS bien à l’avance, avant son accumulation dans le cerveau15. En outre, la présence de p-Syn a été démontrée dans les nerfs de peau des patients présentant des désordres de comportement de REM qui sont considérés prodromal16,17 ainsi la peau pathologique – Syn peut être considérée un périphérique tôt prometteur marqueur histopathologique de synucleinopathy.
L’association de la neuropathie de petite fibre dans a été démontrée précédemment et il a été constaté que la densité intraepidermal de fibres de nerf reflète la progression de la maladie18,19. Par conséquent, la biopsie de peau est un outil utile pour étudier la neurodégénérescence dans la MP et pour établir un diagnostic histopathologique pré-mortem de la maladie. En effet, la biopsie de la peau a un grand avantage d’être une procédure facilement accessible et peu invasive, permettant l’analyse des tissus nerveux enclins à la pathologie. Enfin, la possibilité de répéter la biopsie de la peau au cours du suivi des mêmes patients permet d’étudier la corrélation longitudinale avec la progression de la maladie.
Dans notre laboratoire, l’exploitation d’une double immuno-coloration avec PGP9.5 et l’anticorps monoclonal 5G4 conformation-spécifique, qui reconnaît les formes spécifiques de la maladie de ‘Syn y compris les petits agrégats20,21, nous avons pu montrer le présence d’agrégats syn dans les nerfs de la peau avec une efficacité diagnostique élevée prometteuse19. L’analyse d’immunofluorescence de la biopsie de peau dans les maladies conformationnelles se distingue comme source prometteuse de biomarqueurs en combinant à la fois la détection des agrégats protéiques et la mesure de la neurodégénérescence in vivo. Par la suite, nous illustrons un protocole facile et polyvalent sur la manipulation de la biopsie de peau et l’exécution de la coloration d’immunofluorescence flottante libre pour détecter des agrégats de Syn. En outre, ce protocole peut être adapté pour cibler toute autre protéine d’intérêt exprimée dans la peau PNS.
Le protocole d’étude suivant a été utilisé pour évaluer l’utilité diagnostique de l’analyse agrégée de Syn dans le PNS de la MP par biopsie de peau19. Les critères d’inclusion pour la étaient : un diagnostic clinique défini selon les critères diagnostiques de banque de cerveau du R-U, la durée de la maladie au moins 3 ans, aucune histoire de famille, et aucune affaiblissement cognitif majeur ou symptômes dysautonomic principaux dans l’histoire. Les critères d’exclusion étaient des causes connues de neuropathie (hémoglobine glyquée, créatinine, vitamine B12, TSH, immunofixation du sérum, VIH, VHC, syphilis et borréliose). Chaque sujet a subi des biopsies de peau de 3 millimètres de diamètre à trois emplacements anatomiques (cou au niveau dermatomal de C8, cuisse 10 cm au-dessus du genou, jambe 10 cm au-dessus du malleolus latéral) sur le côté, qui a été médicalement plus affecté. En général, le protocole suivant consiste à traiter la biopsie de la peau et à effectuer la coloration et l’analyse de l’immunofluorescence flottante. Par conséquent, il peut être adapté et utilisé pour la détection d’autres protéines d’intérêt dans les tissus cutanés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons un analyse d’immunofluorescence flottante pour des biopsies de peau pour le diagnostic de : il exploite l’immunostaining double avec l’anticorps anti-PGP9.5, un marqueur panaxonal, et anti-5G4, un anticorps spécifique de conformation qui reconnaît la forme agrégée de Syn.
Les grands avantages de la biopsie de peau pour le but diagnostique dans la MP et probablement dans d’autres désordres conformationnels de protéine sont : 1) l’accès direct au tissu nerveux enclin à la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Parkinson Schweiz et ABREOC (le Conseil consultatif de recherche scientifique de l’Ente Ospedaliero Cantonale) pour leur soutien financier à cette étude.
Materials
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2mg/ml |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2mg/ml |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
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