Summary
Burada, biz Parkinson hastalığı ve multipl proteinleri dahil Alfa Raisin hastalığın spesifik konformasyon türevleri tanımlanması için izin cilt biyopsisi bölümlerde serbest yüzen dolaylı immünofluorescence tahlil için bir protokol sunuyoruz Periferik sinir sistemi.
Abstract
Bugüne kadar, çoğu nörodejeneratif hastalıklar için sadece bir post-mortem histopatolojik kesin tanı mevcuttur. Parkinson hastalığı (PD) için, tanı hala sadece hastalık kursunda daha sonra görünür motor tutulumu klinik belirtileri dayanır, dopaminerjik nöronların çoğu zaten kaybolduğunda. Bu nedenle, hastalığın başlangıcında veya onu geliştirme riskinde hastaları tanımlayabilir bir biyomarker için güçlü bir ihtiyaç vardır. Son birkaç yıl içinde, cilt biyopsisi, küçük lif nöropati gibi periferik sinir hastalıkları için mükemmel bir araştırma ve tanı aracı olduğunu kanıtladı. İlginç bir şekilde, PD hastalarında cilt biyopsisi ile küçük lif nöropati ve Alfa Raisin (αsyn) nöral tortuları gösterildi. Nitekim, cilt biyopsisi, patolojiye eğilimli periferik sinir dokusunun analizini sağlayan, kolayca erişilebilen, minimal invazif ve ağrısız bir prosedür olmanın büyük avantajına sahiptir. Dahası, aynı hastanın takip esnasında deri biyopsisi tekrarlanması olasılığı, hastalığın ilerlemesi ile uzunlamasına korelasyon incelenmesi sağlar. PD hastasının cilt sinir lifleri içinde αSyn toplamaların varlığını araştırmak için standardize edilmiş güvenilir bir protokol kuracağız. Bu protokol, birkaç kısa sabitleme adımlarını, bir cryotome bölümlendirmesini ve daha sonra iki spesifik antikorla serbest yüzen immünofluorescence çift lekeleme içerir: Anti protein gen ürün 9,5 (PGP 9.5) tespit için kutanöz sinir lifleri ve anti 5G4 işaretlemek için αSyn toplamları. Bu da cilt sinirleri ilgi diğer proteinlerin hedefleme için uygulanabilir bir çok yönlü, hassas ve kolay bir protokoldür. ΑSyn toplamalarını işaretleme yeteneği, PD 'nin önceden mortem histopatolojik tanısı oluşturmak için bir araç olarak cilt biyopsisi kullanımı için bir adım daha ileri bir adımdır.
Introduction
Cilt biyopsisi nörolojik bozukluklar alanında teşhis ve araştırma aracı olarak büyük önem kazanmıştır1. Nitekim, epidermis ve dermis bol somatik duyusal sinir lifleri (myelinated ve myelinated), nociceptif serbest sinir sonlar, duyusal reseptörleri ve ter bezleri, damarların, yağ bezleri ve kas arrektor leiomiyomlardır otonoma innervasyonu içerir 2' ye kadar.
Orta-20inci yüzyılda, PGP 9.5 antikor immünhistokimya için kurulum insan epidermis memelinin deri3geniş bir innervasyon kanıtı izin verdi. PGP 9.5, hem merkezi hem de periferik sinir sisteminin (PNS) akons boyunca eşit olarak dağıtılan bir karboksil-Terminal hidrolaz 'dir. Bu antikor mevcudiyeti sadece cilt PNS Morfoloji ve anatomisini açıklığa kavuşturmak için izin değil, aynı zamanda bu ile ilişkili hastalıkların çalışma uygulanan3,4. Cilt biyopsisi yeni bir klinik obje tanımlamak için katkıda bulunmuştur: küçük lif nöropati. Çeşitli uluslararası gruplar intraepidermal sinir lifleri ve belirtiler/küçük lif nöropati belirtileri kaybı arasındaki ilişkiyi göstermiştir5 cilt biyopsisi analizi ile ve sinir morfometri için standart protokoller sağlanan yanı sıra klinik uygulamada kullanılmak üzere normatif referans değerleri6,7,8.
Son zamanlarda büyük miktarda kanıt, nörodejeneratif hastalıkların, merkezi sinir sistemindeki yanlış katlanan protein birikimleri ile karakterize olduğunu göstermiştir, Multi-sistem patolojileri9. Gerçekten de, PD, kanıtlanmışdopaminerjik nöron içinde αsyn birikimi ile karakterize, ancak αsyn ve patolojik formu, fosforile αsyn (P-αsyn), periferik dokularda da tespit edilebilir olduğunu göstermiştir. Gastro-intestinal mukoza10, tükürük bezleri11, ter bezleri ve pilomotor kasları çevreleyen cilt otonjik lifleri12,13,14, αsyn patojen formları için immünoreactivity göster, Braak hipotezi ile ilgili olarak, αSyn patolojisinin beyinde birikiminden önce, PNS 'de önceden de başlayabilir. Dahası, p-αsyn varlığı, prodromal PD olarak kabul edilen REM davranış bozuklukları olan hastaların cilt sinirinde gösterildi16,17 böylece deri patolojik αsyn umut verici bir erken periferik olarak kabul edilebilir synucleinopati histopatolojik Marker.
PD 'de küçük lif nöropati Birliği daha önce gösterildi ve intraepidermal sinir liflerinin yoğunluğu hastalığın ilerlemesini yansıtan bulunmuştur18,19. Bu nedenle, cilt biyopsisi PD 'de nörodejenerasyonun incelenmesi ve hastalığın ön mortem histopatolojik tanısı oluşturmak için yararlı bir araçtır. Nitekim, cilt biyopsisi, patolojiye eğilimli sinir dokusunun analizine izin vererek kolayca erişilebilen ve minimal invaziv bir prosedür olmaktan büyük bir avantaj sağlar. Son olarak, aynı hastaların takip esnasında deri biyopsisi tekrarlanması olasılığı, hastalığın ilerlemesi ile uzunlamasına korelasyon incelenmesi sağlar.
Laboratuvarımızda, PGP 9.5 ve konformasyon özel monoklonal 5g4 antikor ile çift immüno-boyama sömürüyor, bu αsyn küçük agrega dahil hastalık spesifik formları tanır20,21, biz göstermek başardık umut verici yüksek tanı verimliliği ile cilt sinirleri αSyn toplamları varlığı19. Konformasyonel hastalıklarda cilt biyopsisi immünofluorescence Analizi hem protein agregaları tespiti hem de nörodejenerasyonun ölçüleri arasında kombine edilerek, umut verici bir biyomarkerlerin kaynağı olarak öne çıkmaktadır. Bundan sonra, cilt biyopsisi ile ilgili kolay ve çok yönlü bir protokol gösteriyoruz ve αSyn toplamalarını tespit etmek için serbest yüzen immünofluoresesans lekesini gerçekleştirme. Dahası, bu protokol cilt PNS ifade ilgi diğer protein hedefleme için adapte edilebilir.
Aşağıdaki çalışma protokolü, pH 'nin PNS 'inde toplanan αSyn analizinin tanı yardımcı programını cilt biyopsisi19ile değerlendirmek için kullanılmıştır. PD için dahil etme kriterleri: INGILTERE beyin Bankası teşhis kriterlerine göre kesin bir klinik tanı, hastalık süresi en az 3 yıl, hiçbir aile öyküsü, ve önemli bir bilişsel bozukluk ya da tarihin önemli dysautonomic belirtileri. Dışlama kriterleri nöropati nedenleri bilinen (glycated hemoglobin, kreatinin, B12 vitamini, TSH, serum immünofixation, HıV, HCV, frengi, ve borreliosis). Her konu üç anatomik bölgelerde 3 mm çapında cilt biyopsileri (C8 dermatomal seviyede boyun, diz üstünde uyluk 10 cm, lateral Malleolus üzeri bacak 10 cm) ve klinik olarak daha etkilenmiştir. Genel olarak, aşağıdaki protokol cilt biyopsisi işleme ve serbest yüzen immünofluorescence boyama ve analiz gerçekleştirme hakkında. Bu nedenle adapte edilebilir ve cilt dokusu ilgi diğer proteinlerin tespiti için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokol, Cantonal Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır ve tüm kayıtlı konular araştırmaya yazılı onay verdi.
1. cilt biyopsisi koleksiyonu
- Nitelikli bir doktorun, deri biyopsisi uygun bir klinik ortamda gerçekleştirmesini sağlar.
- Cilt biyopsisi yapmak ve bir alkol çubuk ile temizlemek için alanı seçin.
- Anestezik solüsyonu 1 cc lidokain% 2 ile hazırlayın.
- Alana paralel iğne ile lokal anestezi subkutan enjekte edilir.
- Anestezi etkisini kontrol ettikten sonra, 3 mm tek kullanımlık yumruk alın ve subkutan yağ ulaşılana kadar, epidermis ve dermis aşağı döndürmek için rotasyonel ve hassas aşağı basınç uygulayın.
- Yumruk çek.
- Cilt fişini hafifçe çekmek için tek kullanımlık forseps kullanın.
- Numunenin tabanı yağ dokusu seviyesinde kesmek için makas kullanın.
- Numuneyi 10 mL periodate-Lysine-paraformaldehyde (PLP) Fiks çözeltisi içeren bir tüpün içine yerleştirin.
- Alanı dezenfekte edin ve yapışkan bir bandaj ile koruyun.
2. doku Fikreme ve depolama
- Yeni PLP fiksatif solüsyonu yapın (bkz. Tablo 1).
- Cilt biyopsisi koleksiyonundan hemen sonra, 10 mL PLP fiksatif solüsyonu içeren bir tüpte onu battırın ve 4 °C ' de gecede (O/N) kulkarın.
- Sonra, duman kaputu altında, hafifçe ve aynı tüpte PLP fiksatif çıkarın, 5 mL 0,1 M Sorensen çözeltisi ile 5 dakika biyopsi yıkayın (Tablo 1).
- Sorensen 'in çözümünü atın ve biyopsisi 4 °C ' de 5 mL Cryo-protektant çözeltisi olan O/N ile kuluçla.
- Bir cryotome ile kesme 1 hafta içinde gerçekleştirildiğinde biopsini 4 °C ' de saklayın; biyopsi 3 ay içinde gerçekleştirildiğinde-20 °C ' de saklayın; biyopsi bir cryomold embed (adımlar 3.2-3.4) ve daha uzun bir süre için korumak için-80 °C ' de saklayın.
3. bir Cryotome ile doku kesme
- Cryotome 'yi-20 °C ' de ayarlayın.
- Bir cryomold alın ve Cryo-gömme ortamı ile doldurun. Kabarcıklar yaratmaktan kaçının.
- Cımbız kullanmak, biyopsisi, ağarın altına paralel olarak uzunlamasına eksen (epidermis-DermIS) ile Cryo-katıştırma ortamına daldırın.
- Bu numuneyi, biyopsiyi doğru yönde içeren Kriyo katıştırma ortamının katı bir küpünü elde etmek için sıvı nitrojen ile dondurabilirsiniz.
- Numuneyi kriyostat 'a koyun ve biyopsinin acclimatize edilmesine izin vermek için 30 dakika bekleyin.
- Örnek kriyostat ve kesme 50 μm bölümler üzerinde düzeltin.
- Küçük bir fırça yardımıyla, her kuyunda 200 μL antifriz çözeltisi içeren 96 iyi bir plakanın içinde Cryo-bölümlerini aktarın. İyi başına bir bölüm.
- -20 °C ' de saklayın.
Not: Eğer analiz tüm biyopsi analiz edilmiyor, sadece kısmen kesti. Bu durumda, bölümler-20 °C ' de ve biyopsinin kalan kısmı-80 °C ' de daha uzun süre muhafaza edilmelidir.
4. immünofluorescence boyama
- 100 μL yıkama çözeltisi ile 96 iyi bir plaka doldurun.
- Depolama plakasından analiz edilecek bölümleri, çamaşır çözeltisi içeren yeni birine aktarın. Her kuyu için 1 kısım (anatomik site başına 4 bölüm, hasta başına: hasta başına genellikle toplam 12 bölüm).
- Oda sıcaklığında (RT) 10 dakika yıkama çözeltisi bölümünde bırakın. Aynı çözümü içeren başka bir kuyu içine bölümü aktarmak ve yıkama tekrarlayın.
- Bölümleri 100 μL engelleme çözümünü içeren yeni kuyulara taşıyın ve en az 90 dakika ve RT 'de en fazla 4 saat boyunca inküye yapın.
- Primer antikorlar Anti-PGP 9.5 (tavşan polyclonal, 1:1000) ve anti-5G4 (fare monoklonal, 1:400) çalışma çözeltisi seyreltilmeli.
- Bölümleri primer antikorların çalışma çözeltisi 100 μL içeren yeni kuyulara aktarın ve RT 'de O/N 'yi inkük.
- Adım 4,3 olarak, 100 μL yıkama çözeltisi ile 2 kez RT 'de en az 10 dakika boyunca bölümleri yıkayın.
- İkincil antikorları seyreltin (farklı fluorophores ile konjuyum) keçi Anti-tavşan algılamak için PGP 9.5 (1:700) ve bir keçi Anti-Mouse tespit etmek 5G4 (1:700) çalışma çözümü.
- RT 'de 90 dk için ikincil antikorların çalışma çözeltisi 100 μL içeren yeni kuyuların içine bölümleri aktarın. Bu noktadan itibaren, alüminyum folyo ile 96 iyi plaka kapağı ikincil antikor/ies ile conjuated fluorophore ağartma önlemek için.
- Adım 4,3 olarak, en az 10 dakika için 2 kez, 100 μL yıkama çözeltisi ile bölümleri yıkayın.
- Bölümleri RT 'de 5 dakika boyunca DAPı 100 μL (PBS 1x 'de seyreltilmiş 1:5000) içeren yeni kuyulara aktarın.
- Adım 4,3 olarak, en az 10 dakika için 2 kez, 100 μL yıkama çözeltisi ile bölümleri yıkayın.
- Bir slayttaki bölümleri yanlış katlamadan kaçınarak doğru konumda bağlayın.
- Slayt üzerinde montaj ortamının birkaç damla ekleyin ve bir coverslip ile kapak.
- Konfokal/floresan mikroskobu kullanmadan önce slaytlar kuru O/N edelim.
- Slaytları 4 °C ' de uygun bir kutuda saklayın. Doğru şekilde depolanırsa, sinyal yaklaşık 6 ay boyunca görünür olacaktır.
Not: Yeni kesilmiş dilimleri içeren 96 iyi plakalı bir bölümün transferi, çamaşır çözeltisini içeren 96 iyi plakaya (adım 4,1) biyopsi almaya yardımcı olan küçük bir fırça kullanılarak gerçekleştirilir. İlk kuyu içine bölümün transferinden sonra, dilim farklı bir çözüm ile inkübe gereken her zaman, iyi fırça yardımıyla iyi taşıyın.
5. immünofluorescence görüntüleme
- Ters Floresan Mikroskobu veya Konfokal mikroskop (20X, 40X veya daha yüksek büyütme) altındaki bölümleri görüntüleyin, en iyi sonuçlar için Z yığını planında 2 μm artışlarla ardışık çerçeveler kullanın.
- Mikroskop bağlı kamera ile görüntü edinme
-
Sinyalin uzamsal dağılımı ve yoğunluğu açısından bölümlerdeki pozitif sinyalleri çözümlemek için yeterli görüntüleme yazılımı (örn. ımagej) kullanın. Bunu yapmak için aşağıda belirtilen adımları gerçekleştirin.
- Imagej yazılımı ile dosyayı açın.
- Her renk kanalını çözümlemek için görüntü > renk > bölünmüş kanalları tıklayın.
- Birden çok bölüm alımları birleştirme elde etmek için görüntü > yığını ≫ Z proje tıklatın.
- Aynı edinme farklı renk kanalları birleştirme elde etmek için kanalları birleştirmek ≫ resim > renk 'i tıklatın.
|
Antifriz çözeltisi (6 aya kadar 4 °C ' de saklayın) |
% 30 gliserol % 30 etilen glikol 30% dH2O % 10 2x fosfat tampon |
|
Engelleme çözümü (Şu anda hazırlayın) |
% 4 normal keçi serumu 1% Triton X-100 Yıkama solüsyonu |
|
Cryo-protektant (6 aya kadar 4 °C ' de saklayın) |
% 20 gliserol 80% Sorensen 'in çözümü |
|
Disodyum hidrojen fosfat çözeltisi (RT 6 ay kadar mağaza) |
0.45 m disodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) dH2O Steril bir şişede filtre |
|
Lizin solüsyonu (3 haftaya kadar 4 °C ' de saklayın) |
50% 0.3 M L-Lysine monohidroklorür çözeltisi 50% 0.1 M Sorensen 'in çözeltisi pH 7.6 pH 7,4, steril bir şişede filtre |
|
Paraformaldehyde (PFA) 8% (1 aya kadar 4 °C ' de duman kaputu ve mağaza altında hazırlayın) |
2.6 m PFA dH2O (ila 55 °C _do 60 °C ' den fazla değil, steril bir şişe içinde filtre |
|
Fosfat tampon 2x (6 aya kadar 4 °C ' de saklayın) |
% 6 Monosodyum fosfat (NaH2PO4) çözeltisi 45 dH2O 'da% disodyum fosfat (Na2HPO4) çözeltisi |
|
PLP fixatif çözüm (Şu anda hazırlamak, duman kaputu altında) |
% 25 paraformaldehit 8% 0.01 m sodyum (meta) periodate 75% lizin solüsyonu < |
|
Sodyum Dihiddrogen fosfat monohidrat (RT 6 ay kadar mağaza) |
0.52 m sodyum Dihiddrogen fosfat monohidrat (NaH2PO4 * H2O) dH2O Steril bir şişede filtreleyin. |
|
Sorensen 'in çözümü (1 aya kadar 4 °C ' de saklayın) |
2,5% Monosodyum fosfat çözeltisi 18,7% disodyum fosfat çözeltisi pH 7.6, dH2O |
|
Yıkama çözeltisi (Şu anda hazırlayın) |
0.25 m Trizma tabanı 0.26 m NaCl pH 7.6, dH2O |
|
Çalışma çözümü (Şu anda hazırlayın) |
50% engelleme çözümü 50% yıkama çözeltisi |
Tablo 1: Gerekli çözümler. Protokol ve nasıl hazırlanacağınız hakkında kısa bir açıklama için gerekli çözümler listesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Açıklanan prosedürün ardından (Şekil 1), PD hastalarının otonjik yapılarına sahip dermal sinir fasiklerde, 5G4 antikor Ile etiketlenmiş αsyn toplamları tespit ettik. Alfa-synuclein tortularının morfolojisi dermal sinirlerin akons boyunca noktalı sinyal olarak görünür (Şekil 2). Nitekim, 19 PD hastalarında bu protokol ve üç anatomik sitede (servikal, uyluk ve distal bacak) cilt biyopsilerinde 17 kontrol sömürüyor, 5G4 ' ün% 81 duyarlılık ve% 86 ' i sağlıklı kontrollere özgüllük saygı ve P-αSyn ' i n% 56 ' lik hassasiyeti olduğunu bulduk ve% 100 özgüllük%19.
Özellikle, 5G4 ve P-αSyn pozitif tortuları özellikle ter bezlerinin etrafında sinirler içinde ama aynı zamanda kas erector pili, küçük damarlarda, subepidermal ve dermal plekbe, intraepidermal sinir liflerinde asla bulduk.
Genellikle, ter bezi lümen içinde, 5g4/P-αsyn pozitifliği olarak yanlış yorumlanabilir bir nonspesifik sinyal, gözlemlemek mümkündür. Bu tür bir sinyal, küresel noktalı ve büyük olasılıkla intraluminal otomatik floresan malzeme nedeniyle, biz birincil ve ikincil antikorlar olmadan teknik kontroller göstermiştir (Şekil 3). PGP 9.5 ile birlikte lokalizasyon, morfolojik olarak filaentous ve uzamış olan sinir liflerini işaretler, doğru sinyali belirlemenize yardımcı olur. Bu nedenle, 5G4 sinyalinin özgüllüğü, akal işaretleyici ile çift immünostasyon ile yüksek oranda artar (Şekil 4).
Biyopsi doğru bir fiksasyon immünofluorescence boyama iyi kalite için zorunlu bir faktördür, ve floresan sinyallerin güvenilir yorumlanması için. Eğer fiksatif doğru hazırlanmış değilse veya bir aşırı fiktasyon meydana gelse, sonuç dermal-epidermal kavşağından geçen sinir liflerinin sinyalini maskelemek veya ana dermal yapıları insekti eden yüksek bir otomatik floresans olacaktır (Şekil 5 B, D, F). Bu durumda, doğru PGP 9.5 pozitif lifleri görselleştirmek için yetersizlik doğru da 5G4 analiz etmek zor yapacaktır.
Son olarak, bu protokol, başkalarının αSyn, P-αSyn veya tirozin hidroksilaz (TH) ve vazoaktif bağırsak peptid (VIP) arasında da dahil olmak üzere, herhangi bir ilgi proteininin tespiti için kullanılabilir ve bu da sırasıyla adrenergik ve kolinerjik alt tip otonjik (Şekil 6).
Şekil 1 : Protokolün şematik gösterimi. Kutanöz periferik sinir liflerindeki αSyn toplamaların görselleştirilmesi için cilt bölümlerinin sabitleme, kesme ve boyama açısından kritik adımların grafiksel gösterimi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Dermal sinir lifleri 5G4 toplamları varlığı. PD hastalarında (A-C) ve sağlıklı konu (D-F) içinde ter bezleri etrafında dermal sinirlerin PGP 9.5 (yeşil) ve 5g4 (kırmızı) ile immunofluoresesans Z-yığını görüntüleri konfoköz birleştirilir. Bu rakam 19' dan değiştirildi. aynı ter bezi 3D görselleştirme yukarıda PD (G) ve sağlıklı (H) konularda gösterdi. Beyaz oklar, akons boyunca iki işaretçilerin sarı kolokalizasyonu ile gösterilir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 3 : Otomatik floresan sinyalleri: teknik kontroller. Confocal, ikincil antikor (C-D) olmadan, primer ve ikincil antikorlar (E-F) olmadan, DAPI ile ve primer antikor (A-B) olmadan lekelenmiş cilt bölümünün Z-yığını görüntülerini birleştirdi. Görüntüler her koşulda ter bezleri yapılarında spesifik olmayan noktalı sinyallerin varlığını gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 4 : Özel olmayan sinyali tanımak için sinir lifleri morfoloji düşünün. Ter bezleri etrafında dermal sinirlerin PGP 9.5 (yeşil) ve 5g4 (kırmızı) ile immünofloresan zin yığını görüntüleri konfokk birleştirme. Beyaz oklar pozitif yapıları gösterir; asteriskler olmayan nöronal yapılarda spesifik olmayan boyama gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakam19referansından değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5 : Yanlış sabitleme immünofluorescence lekeleme kalitesini tehlikeye atmaktır. Konfokk birleştirme Z-PGP 9.5 (yeşil) ve DAPı (mavi) intra epidermal sinirler lifleri (A-B) ve dermal sinirlerin Sebasöz bezi (C-D) ve ter bezleri (E-F) etrafında immünofluorescence görüntüleri yığını. Doğru sabitleme sol sonucu, üzerinde sabitleme doğru sonucu. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 6 : Cilt sinirlerinde algılanabilir diğer proteinler örnekleri. Dermal yapıların mikroskop görüntüleri bir serbest yüzen immünofluorescence tahlil kullanılarak lekelenmiş. Kırmızı αSyn (A), p-Αsyn (B) ve TH (C), yeşil VIP (D). Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz PD tanısı için cilt biyopsileri için serbest yüzen immünofluorescence tahlil tarif: Bu anti-PGP 9.5 antikor, bir panaxonal Marker ve anti-5G4, toplanan formu tanıyan bir konformasyon spesifik antikor ile çift immünostasyonu istismar , αSyn.
PH 'de tanı amacı ve muhtemelen diğer protein Konformasyonel bozukluklarda cilt biyopsisi için büyük avantajlar şunlardır: 1) hafif invazif bir teknik ile hastalığa eğilimli sinir dokusuna doğrudan erişim ve böylece beklenen daha iyi bir kararlılık kan veya CSF gibi biyolojik sıvılardan daha αSyn toplamları için duyarlılık; 2) nörodejenerasyonun bir ölçüsü olarak Epidermal ve otonoma sinir lifinin yoğunluğu tespit etmek ve ölçmek için fırsat; 3) aynı hastaların takip sırasında cilt biyopsisi tekrarlanması olasılığı, hastalığın ilerlemesiyle boyuna korelasyon çalışma amacıyla.
Burada önerilen protokol hızlı, çok yönlü ve birkaç kritik adımlara sahiptir. Her şeyden önce, doku fikreme doğru şekilde takip edilmelidir, aksi takdirde yüksek bir otomatik floresans belirli sinyali maskeleyebilir ve verilerin doğru analizini önleyecek. Fikzatif çözelti içindeki paraformaldehit taze yapılmalıdır ve 7,4 pH doğru şekilde kontrol edilmelidir. Biopsilerin zarar verebilecek formik asit oluşumunu önlemek son derece önemlidir. Depolama ve kesme işleminden önce, biyopsi kompakrlığı yanlış bir fiksasyon önerdiği takdirde, biyopsi Sorensen çözeltisi ile tekrar durulanır ve 4 °C ' de PLP çözeltisi O/N ile yeniden inküpledir. Dahası, başlangıçta veya immünofluorescence boyama protokolünün sonunda, otomatik floresans karşı koymak için birkaç ek adımlar tanıtılabilir. Protokol başında (4,1 ve 4,2 arası adımlar arasında), sodyum orhidrit çözeltisi (TBS 'de 1 mg/mL; 10 dk için 3 kez), hidrojen peroksit (% 3; 15 dk) veya glikli bir tedavi (TBS 'de 0,1 M; 1s) ile bir tedavi yapılabilir. Boyama sonunda alternatif olarak (adımlar 4,8 ve 4,9 arasında), tripan mavi (250 μg/mL TBS; 20 dk) veya sudan siyah (% 0,5% 70 EtOH; 30 dk) ile bir tedavi yapılabilir. Ancak, her durumda, otomatik floresans azalmasına ek olarak, belirli sinyalde bir azalma da ortaya çıkar. Alternatif olarak, yanlış sabitlenmiş biyopsiler klasik parlak alan immünhistokimya gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu durumda, ancak, 5g4 ve PGP 9.5 kolokalizasyonu için çift immün boyama daha zorlu ve analiz etmek zor olacaktır.
Başka bir kritik adım cryomold içine bir cilt biyopsisi ekleme (adım 3,3). Biyopsinin kesme bıçağa yönelmesi, epidermis ve dermis her ikisi de mevcut olan dilimleri elde etmek için çok önemlidir. Uzunlamasına eksen (epidermis-DermIS), ağarın alt kısmına paralel olmalıdır, böylece biyopsi, üst veya alt değil, operatöre karşı karşıya olacaktır. 50 μm olan dilim kalınlığı seçimi, tanı aracı olarak cilt biyopsisi kullanımı için Avrupa yönergelerine uygun olarak7. Ayrıca, αSyn toplama algılama için, 50 μm kalınlığı daha büyük olasılık daha dermal yapıları, patolojik depozito ağırlıklı olarak PD bulunur içinde olması için izin verir. yüksek kalınlığa bağlı olarak, tüm bölümün boyalı olduğundan emin olmak için, boyama için slaytta bölümler yerleştirmek için tavsiye edilmez, ancak bunun yerine, ücretsiz yüzen boyama zorunludur. Bu prosedür için, büyük zorluk bölümlere zarar vermeden küçük bir fırça kullanarak bir iyi diğerine bölümleri aktarmak için. Bu sıvı içinde yüzen biyopsi altında fırça ucunu eklemek için tavsiye edilir, bu biyopsi fırça ucuna yerleşmek için izin, nazikçe bir iyi diğerine biyopsi taşımak, yeni çözelti içinde biyopsi batırmak ve emin olmak için fırça kaldırmak fırçaya biyopsi kalıntısı bırakılmıştı. Operatörün uygulama ile manuel beceriler kazanması önemlidir.
Sonuç olarak bu, cilt biyopsisi için optimum kullanım ve floresan immünostize etmek için kısa ve kolay bir protokoldür. Bu protokolün önceki çalışmalara ilişkin avantajı, PD hastalarının dermal otonjik sinir liflerinde ilk kez αSyn küçük agregaların algılanmasını sağlayan 5G4 antikor kullanımı. Potansiyel tedavi en etkili olabilir, özellikle erken fazlarda, PNS içeren nörodejeneratif bozukluklar farklı türde teşhis amacıyla kullanılabilir. Yöntemin sınırlamaları, P-αSyn ' i n hassasiyeti ve 5G4 ' ün özgüllüğü hala hassasiyetli olmakla birlikte, gelecekteki çalışmalarda farklı belirteçlerin bir kombinasyonu PD 'de deri biyopsisinin teşhis verimi kesinlikle artırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışmanın mali desteği için Parkinson Schweiz ve ABREOC (Ente Ospedaliero Cantonale bilimsel araştırma Danışma Kurulu) teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2 mg/mL |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2 mg/mL |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
References
- McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist's Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
- Wilkinson, P. F., Millington, R. Skin. , Cambridge University Press. Cambridge. ISBN 978-0-521-10681-8 49-50 (2009).
- Weddell, G., et al.
- Wang, L., et al. Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin. Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).
- Holland, N. R., et al. Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy. Neurology. 48, 708-711 (1997).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).
- Provitera, V., et al. A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg. European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).
- Wakabayashi, K., et al. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).
- Ruffmann, C., et al. Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease. Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).
- Lee, J. M., et al. The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).
- Donadio, V., et al. Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease. Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).
- Doppler, K., et al. Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology. Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).
- Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy. Brain. 138, 2310-2321 (2015).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).
- Doppler, K., et al. Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease. Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).
- Antelmi, E., et al. Skin nerve phosphorylated α-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder. Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).
- Nolano, M., et al. Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study. Acta Neuropathologica. , (2018).
- Melli, G., et al. Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).
- Kovacs, G. G., et al. Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread. Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).
- Kovacs, G. G., et al. An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology. Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).
