Här presenterar vi ett protokoll för en fritt flytande indirekta immunofluorescens assay på huden biopsi sektioner som gör det möjligt att identifiera sjukdomsspecifika kon formation varianter av alfa-Synuclein inblandade i Parkinsons sjukdom och flera proteiner i perifera nerv systemet.
Hittills, för de flesta neurodegenerativa sjukdomar endast en obduktion histopatologisk definitiv diagnos är tillgänglig. För Parkinsons sjukdom (PD), diagnosen fortfarande förlitar sig endast på kliniska tecken på motorisk inblandning som visas senare i sjukdomsförloppet, när de flesta av dopaminerga nerv celler är redan förlorat. Därför finns det ett starkt behov av en bio markör som kan identifiera patienter i början av sjukdomen eller med risk att utveckla den. Under de senaste åren har hudbiopsi visat sig vara en utmärkt forskning och diagnostiska verktyg för perifera nerv sjukdomar såsom små fiber neuropati. Intressant, en liten fiber neuropati och alpha Synuclein (αSyn) neurala insättningar har visats av hudbiopsi hos PD-patienter. I själva verket har hudbiopsi den stora fördelen av att vara en lättillgänglig, minimalt invasiva och smärtfri förfarande som gör det möjligt att analysera perifera nervvävnad benägna att patologin. Dessutom, möjligheten att upprepa hudbiopsi i samband med uppföljningen av samma patient gör det möjligt att studera den längsgående korrelation med sjukdomsprogression. Vi satte upp ett standardiserat tillförlitligt protokoll för att undersöka närvaron av αSyn aggregat i hud nerv fibrer av PD-patienten. Detta protokoll innebär få kort fixering steg, en cryotome snittning och sedan en fritt flytande immunofluorescens dubbel färgning med två specifika anti kroppar: anti protein Gene produkt 9,5 (PGP 9.5) för att markera den kutana nerv fibrer och anti 5g4 för att upptäcka αSyn aggregat. Det är en mångsidig, känslig och lätt att utföra protokoll som också kan tillämpas för att rikta andra proteiner av intresse i hud nerver. Förmågan att markera αSyn aggregat är ytterligare ett steg framåt till användningen av hudbiopsi som ett verktyg för att fastställa en pre-mortem histopatologisk diagnos av PD.
Hudbiopsi har fått en stor betydelse som diagnostiska och forsknings verktyg inom området neurologiska sjukdomar1. I själva verket innehåller epidermis och dermis rikliga somatiska sensoriska nerv fibrer (myeliniserade och unmyelinated), nociceptiva fria nerv ändar, sensoriska receptorer och autonom innervation av svett körtlar, fartyg, talgkörtlar och muskel arrector pilorum och 2.
I mitten av 20- talet, den setup för immunhistokemi av PGP 9.5 anti kropp tillät bevis på en omfattande innervation av mänskliga epidermis däggdjur hud3. PGP 9.5 är en carboxyl-Terminal hydrolas jämnt fördelad längs axoner av både centrala och perifera nerv systemet (PNS). Tillgängligheten av denna anti kropp tillät inte bara att klargöra morfologi och anatomi PNS i huden utan också genomfört studiet av sjukdomar i samband med det3,4. Hudbiopsi bidrog till att definiera en ny klinisk enhet: den lilla fiber neuropati. Flera internationella grupper visade sambandet mellan förlusten av intraepidermal nerv fibrer och symtom/tecken på små fiber neuropati5 av hudbiopsi analys och förutsatt standardiserade protokoll för nervmorphometry samt normativa referensvärden som skall användas i den kliniska praxisen6,7,8.
Nyligen en stor mängd bevis har visat att neurodegenerativa sjukdomar, som kännetecknas av felvikt protein ackumulationer i centrala nerv systemet, är flera system patologier9. I själva verket kännetecknas PD av αSyn ackumulering i dopaminerga neuron i substantia nigra, men det har visats att αsyn och dess patologisk form, fosforylerade αsyn (P-αsyn), kunde upptäckas också i perifera vävnader. Gastrointestinalt slem hinna10, saliv körtlar11, hud autonoma fibrer som omger svett körtlar och pilomotor muskler12,13,14, Visa immunoreaktivitet mot patogena former av αsyn, i enlighet med Braak hypotes som spännande postulat att αsyn patologi kan börja i PNS i god tid, innan dess ackumulering i hjärnan15. Vidare har förekomsten av p-αsyn påvisats i hud nerver hos patienter med rem-beteende störningar som anses prodromala PD16,17 på så sätt kan hudpatologiskt αsyn anses vara en lovande tidig perifer histopatologisk markör för synucleinopati.
Föreningen av små fiber neuropati i PD har visats tidigare och det har kon stater ATS att intraepidermal nerv fibrer densitet återspeglar sjukdomsprogression18,19. Därför är hudbiopsi ett användbart verktyg för att studera neurodegeneration i PD och för att etablera en pre-mortem histopatologisk diagnos av sjukdomen. I själva verket har hudbiopsi en stor fördel av att vara en lättillgänglig och minimalt invasiva förfarande, vilket gör att analysen av nervvävnad benägna att patologin. Slutligen, möjligheten att upprepa hudbiopsi i samband med uppföljning av samma patienter gör det möjligt att studera den längsgående korrelation med sjukdomsprogression.
I vårt laboratorium, utnyttja en dubbel immuno-färgning med PGP 9.5 och kon formation specifika monoklonala 5g4 anti kropp, som erkänner sjukdomsspecifika former av αsyn inklusive små aggregat20,21, kunde vi Visa den förekomst av αSyn aggregat i hudens nerver med en lovande hög diagnostisk verknings grad19. Immunofluorescens analys av hudbiopsi i överensstämningssjukdomar framstår som en lovande källa till bio markörer genom att kombinera både upptäckten av protein aggregat och måttet på neurodegeneration in vivo. Härefter illustrerar vi ett enkelt och mångsidigt protokoll om hantering av hudbiopsi och utförande av fritt flytande immunofluorescens-färgning för detektion av αSyn-aggregat. Dessutom kan detta protokoll anpassas för att inrikta sig på alla andra intresse proteiner som uttrycks i hud-PNS.
Följande studie protokoll har använts för att utvärdera diagnos nyttan av aggregerad αSyn-analys i PNS för PD med hudbiopsi19. Inklusionskriterier för PD var: en definitiv klinisk diagnos enligt den brittiska Brain Bank diagnostiska kriterier, sjukdoms tid minst 3 år, ingen släkt historia, och ingen större kognitiv svikt eller stora dysautonomiska symptom i historien. Uteslutnings kriterier var kända orsaker till neuropati (glycated hemoglobin, kreatinin, vitamin B12, TSH, serum immunofixation, HIV, HCV, syfilis, och borrelios). Varje ämne genomgick 3 mm-diameter hudbiopsier på tre anatomiska platser (hals på C8 dermatomal nivå, lår 10 cm ovanför knäet, benet 10 cm över laterala fotled olus) på sidan, som var kliniskt mer drabbade. I allmänhet är följande protokoll om hantering av hudbiopsi och utföra fritt flytande immunofluorescens färgning och analys. Därför kan det anpassas och användas för att upptäcka andra proteiner av intresse för hud vävnad.
Vi beskriver en fritt flytande immunofluorescens test för hudbiopsier för diagnos av PD: det utnyttjar dubbel immunofärgning med anti-PGP 9.5 anti kropp, en panaxonal markör, och anti-5G4, en kon formation specifik anti kropp som erkänner den aggregerade formen av αSyn.
De stora fördelarna med hudbiopsi för diagnostiskt syfte i PD och möjligen i andra proteiner kon Formations rubbningar är: 1) direkt till gång till nervvävnad benägna att sjukdomen genom en milt invasiv teknik och …
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Parkinson Schweiz och ABREOC (den vetenskapliga forsknings råd givande nämnden för Ente Ospedaliero Cantonale) för deras ekonomiska stöd för denna studie.
5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2mg/ml |
AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2mg/ml |
Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
Trizma Base | Sigma | T1503 | |
Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |