Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para um ensaio indireto deflutuação da imunofluorescência em seções da biópsia da pele que permita a identificação de variações específicas da conformação da doença do sinucleína alfa envolvido na doença de Parkinson e nas proteínas múltiplas do sistema nervoso periférico.
Abstract
Até agora, para a maioria de doenças neurodegenerativas somente um diagnóstico definitivo histopatológico post-mortem está disponível. Para a doença de Parkinson (DP), o diagnóstico ainda depende apenas de sinais clínicos de comprometimento motor que aparecem mais tarde no curso da doença, quando a maioria dos neurônios dopaminérgicos já estão perdidos. Assim, há uma forte necessidade de um biomarcador que possa identificar os pacientes no início da doença ou com o risco de desenvolvê-lo. Durante os últimos anos, a biópsia da pele provou ser uma pesquisa excelente e uma ferramenta diagnóstica para doenças periféricas do nervo tais como a neuropatia pequena da fibra. Curiosamente, uma pequena neuropatia de fibra e alfa sinucleína (αsyn) depósitos neurais têm sido mostrados por biópsia de pele em pacientes com DP. Na verdade, a biópsia da pele tem a grande vantagem de ser um procedimento facilmente acessível, minimamente invasivo e indolor que permite a análise do tecido nervoso periférico propenso à patologia. Além disso, a possibilidade de repetição da biópsia cutânea no decorrer do seguimento do mesmo paciente permite estudar a correlação longitudinal com a progressão da doença. Nós definimos um protocolo confiável padronizado para investigar a presença de agregados αSyn em fibras nervosas da pele do paciente com DP. Este protocolo envolve poucas etapas curtas da fixação, um seccionamento do cryotome e então uma imunofluorescência livre-flutuante que mancha dobro com dois anticorpos específicos: anti produto 9,5 do gene da proteína (PGP 9.5) para marcar as fibras de nervo Cutaneous e o anti 5G4 para detectar agregados αSyn. É um protocolo versátil, sensível e fácil de executar que também pode ser aplicado para direcionar outras proteínas de interesse em nervos da pele. A capacidade de marcar agregados αSyn é outro passo em frente para o uso da biópsia cutânea como ferramenta para o estabelecimento de um diagnóstico histopatológico pré-morte de DP.
Introduction
A biópsia cutânea adquiriu grande importância como ferramenta diagnóstica e de pesquisa no campo das desordens neurológicas1. Na verdade, a epiderme e a derme contêm abundantes fibras nervosas sensoriais somáticas (mielinizadas e não mielinizadas), terminações nervosas livres nociceptivas, receptores sensoriais e inervação autonômica de glândulas sudoríparas, vasos, glândulas sebáceas e músculo arrector arrectores o 2.
Em meados do século 20 , a instalação de imunoistoquímica do anticorpo PGP 9.5 permitiu a evidência de uma extensa inervação da epiderme humana3. O PGP 9.5 é um hidrolase do carboxyl-terminal distribuído ingualmente ao longo dos axônios do sistema nervoso central e periférico (PNS). A disponibilidade deste anticorpo permitiu não apenas esclarecer a morfologia e a anatomia da PNS na pele, mas também implementar o estudo de doenças associadas a ele3,4. A biópsia da pele contribuiu a definir uma entidade clínica nova: a neuropatia pequena da fibra. Diversos grupos internacionais demonstraram a associação entre a perda de fibras de nervo intraepidérmicas e os sintomas/sinais da neuropatia pequena da fibra5 pela análise da biópsia da pele e forneceram protocolos estandardizados para a morfometria do nervo assim como valores de referência normativos a serem utilizados na prática clínica6,7,8.
Recentemente, uma grande quantidade de evidências mostrou que as doenças neurodegenerativas, caracterizadas por acumulações de proteínas desdobradas no sistema nervoso central, são patologias multissistema9. Na verdade, a DP é caracterizada por acúmulo de αsyn no neurônio dopaminérgico de substância negra nigra, mas tem sido demonstrado que αsyn e sua forma patológica, αsyn fosforilada (P-αsyn), poderiam ser detectadas também nos tecidos periféricos. Mucosa gastro-intestinal10, glândulas salivares11, fibras autonômicas da pele que cercam as glândulas sudoríparas e os músculos pilomotores12,13,14, mostram imunoreatividade a formas patogênicas de αsyn, em acordo com a hipótese de Braak que postular intrigantemente que a patologia de αSyn pode começar no PNS bem adiantado, antes de sua acumulação no cérebro15. Além disso, a presença de p-αsyn foi demonstrada em nervos cutâneos de pacientes com distúrbios do comportamento REM, que são considerados PD16,17 assim, a pele patológica αsyn pode ser considerada um promissor periférico precoce marcador histopatológico de sinucleinopatia.
A associação da neuropatia pequena da fibra no paládio foi demonstrada previamente e verificou-se que a densidade intraepidérmicas das fibras de nervo reflete a progressão da doença18,19. Daqui, a biópsia da pele é uma ferramenta útil para estudar a neurodegeneração no paládio e para estabelecer um diagnóstico histopatológico pre-mortem da doença. Na verdade, a biópsia da pele tem uma grande vantagem de ser um procedimento facilmente acessível e minimamente invasivo, permitindo a análise do tecido nervoso propenso à patologia. Finalmente, a possibilidade de repetição da biópsia cutânea no decorrer do seguimento dos mesmos pacientes permite estudar a correlação longitudinal com a progressão da doença.
Em nosso laboratório, explorando um immuno-mancha dobro com PGP 9.5 e o anticorpo 5g4 monoclonal conformation-específico, que reconhece formulários específicos da doença de αsyn que incluem agregados pequenos20,21, nós pudemos mostrar o presença de agregados de αSyn nos nervos da pele com uma eficiência diagnóstica elevada prometedora19. A análise da imunofluorescência da biópsia da pele em doenças conformacional destaca-se como uma fonte promissora de biomarcadores, combinando tanto a detecção de agregados proteicos quanto a medida da neurodegeneração in vivo. Daqui por diante, nós ilustramos um protocolo fácil e versátil em segurar a biópsia da pele e em executar a mancha da imunofluorescência da livre-flutuação para detectar agregados do αSyn. Além disso, este protocolo pode ser adaptado para alvejar toda a outra proteína do interesse expressada no PNS da pele.
O seguinte protocolo de estudo tem sido utilizado para avaliar a utilidade diagnóstica da análise de αSyn agregada na PNS de DP por biópsia cutânea19. Os critérios de inclusão para DP foram: um diagnóstico clínico definitivo de acordo com os critérios diagnósticos do banco do cérebro do Reino Unido, duração da doença pelo menos 3 anos, sem antecedentes familiares e sem comprometimento cognitivo maior ou sintomas dissautonômicos maiores na história. Os critérios de exclusão foram causas conhecidas de neuropatia (hemoglobina glicada, creatinina, vitamina B12, TSH, Imunofixação sérica, HIV, HCV, sífilis e borreliose). Cada sujeito foi submetido a biópsias cutâneas de 3 mm de diâmetro em três sítios anatômicos (pescoço no nível dermatomal C8, coxa 10 cm acima do joelho, perna 10 cm acima do maléolo lateral) no lado, o que foi clinicamente mais afetado. Geralmente, o seguinte protocolo é sobre a manipulação da biópsia da pele e a realização da coloração e da análise livre-flutuantes da imunofluorescência. Daqui pode ser adaptado e usado para a deteção de outras proteínas do interesse no tecido da pele.
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Protocol
O protocolo foi aprovado pelo Comitê de ética cantonal e todos os sujeitos inscritos deram o consentimento informado por escrito ao estudo.
1. coleção da biópsia da pele
- Deixe um médico qualificado realizar a biópsia da pele em um ajuste clínico apropriado.
- Escolha a área para realizar a biópsia da pele e limpe-a com um cotonete de álcool.
- Prepare a solução anestésica com 1 cc de lidocaína 2%.
- Com a agulha paralela à área, injete a anestesia local subcutaneously.
- Após verificar o efeito da anestesia, tome o perfurador descartável de 3 milímetros e aplique a pressão descendente rotacional e delicada para girá-la para baixo através da epiderme e da derma, até que a gordura subcutaneous esteja alcangado.
- Retire o soco.
- Use Fórceps descartável para puxar suavemente a ficha da pele para cima.
- Use tesouras para cortar a base da amostra ao nível do tecido adiposo.
- Coloque a amostra em um tubo contendo 10 mL de solução fixativa de periodato-lisina-paraformaldeído (PLP).
- Desinfete a área e cubra-a com uma atadura adesiva.
2. fixação e armazenamento do tecido
- Faça uma solução de fixação PLP fresca (ver tabela 1).
- Imediatamente após a coleta da biópsia cutânea, mergulhe-a em um tubo contendo 10 mL de solução fixativa de PLP e incubar-o durante a noite (O/N) a 4 ° c.
- O dia após, a capa da fumaça, remover suavemente o fixador PLP e no mesmo tubo, lavar a biópsia 3 vezes por 5 min com 5 mL de 0,1 M de solução de Sorensen (tabela 1).
- Descartar a solução de Sorensen e incubar a biópsia com 5 mL de solução de crio-Protectant O/N a 4 ° c.
- Guarde a biópsia a 4 ° c se o corte com um criótomo for realizado dentro de 1 semana; Guarde a biópsia a-20 ° c se o corte for realizado dentro de 3 meses; incorporar a biópsia em um cryomold (etapas 3.2-3.4) e armazená-lo em-80 ° c para conservá-lo por um período de tempo mais longo.
3. corte do tecido com um Cryotome
- Ajuste o cryotome em-20 ° c.
- Tome um cryomold e encha-o acima com o meio Cryo-incorporando. Evite criar bolhas.
- Usando pinças mergulhe a biópsia no meio de crio-incorporação com o eixo longitudinal (epiderme-derme) paralelo à parte inferior do criomofo.
- Fixar o congelamento da amostra com nitrogênio líquido para obter um sólido cubo de crio-incorporação de meio contendo a biópsia na orientação certa.
- Coloque a amostra no criostat e aguarde 30 min para permitir que a biópsia acclimatize.
- Fixe a amostra no criostat e corte as secções de 50 μm.
- Com a ajuda de uma pequena escova, transfira as criosecções numa placa de 96 poços contendo 200 μL de solução anticongelante em cada poço. Uma seção por poço.
- Conservar a-20 ° c.
Nota: Se a análise de toda a biópsia não for analisada, corte-a apenas parcialmente. Neste caso, as secções devem ser armazenadas a-20 ° c e a parte remanescente da biópsia a-80 ° c para a conservar durante um período de tempo mais prolongado.
4. coloração da imunofluorescência
- Encha uma placa de 96 poços, com 100 μL de solução de lavagem.
- Transfira as secções a serem analisadas a partir da placa de armazenamento para a nova que contém a solução de lavagem. 1 seção por cada poço (4 seções por o local anatômico, por o paciente: geralmente um total de 12 seções por o paciente).
- Deixe a secção na solução de lavagem durante 10 min à temperatura ambiente (RT). Transfira a secção para outro poço que contenha a mesma solução e repita a lavagem.
- Mova as secções para novos poços contendo 100 μL de solução de bloqueio e incubar durante pelo menos 90 min e para um máximo de 4 h em RT.
- Diluir os anticorpos primários anti-PGP 9.5 (Rabbit Polyclonal, 1:1000) e anti-5G4 (rato monoclonal, 1:400) na solução de trabalho.
- Transfira as secções para novos poços contendo 100 μL da solução de trabalho dos anticorpos primários e incubar O/N na RT.
- Como passo 4,3, lave as secções 2 vezes durante pelo menos 10 min em RT, com 100 μL de solução de lavagem.
- Diluir os anticorpos secundários (conjugado com diferentes fluoróforos) goat anti-Rabbit para detectar PGP 9.5 (1:700) e um goat anti-mouse para detectar 5G4 (1:700) na solução de trabalho.
- Transfira as secções para novos poços contendo 100 μL da solução de trabalho dos anticorpos secundários durante 90 min em RT. A partir deste ponto, cubra a placa 96 bem com folha de alumínio para evitar o branqueamento de fluoróforo conjugado com anticorpo secundário/s.
- Como passo 4,3, lave as secções 2 vezes durante pelo menos 10 min, com 100 μL da solução de lavagem.
- Transfira as secções para novos poços contendo 100 μL de DAPI (diluído 1:5000 em PBS 1x) durante 5 min em RT.
- Como passo 4,3, lave as secções 2 vezes durante pelo menos 10 min, com 100 μL da solução de lavagem.
- Monte as seções em um slide na posição correta evitando o desdobramento.
- Adicione algumas gotas do meio de montagem no slide e cubra com uma lamínula.
- Deixe as lâminas secar O/N antes de utilizar o microscópio confocal/fluorescência.
- Armazene os slides em uma caixa apropriada a 4 ° c evitando a exposição à luz. Se armazenado com precisão, o sinal será visível por cerca de 6 meses.
Nota: A transferência de uma seção da placa de poço 96 contendo as fatias recém-cortadas para a placa de poço 96 contendo a solução de lavagem (passo 4,1) é realizada usando uma pequena escova que ajuda a pegar a biópsia. Após a transferência da seção para o primeiro poço, cada vez que a fatia precisa ser incubada com uma solução diferente, movê-lo de bem a bem com a ajuda do pincel.
5. imagiologia por imunofluorescência
- Veja seções um microscópio de fluorescência invertido ou um microscópio confocal (20X, 40x ou ampliação mais elevada, use frames sucessivos de incrementos de 2 μm em um plano da Z-pilha para melhores resultados).
- Adquira imagens por uma câmera conectada ao microscópio
-
Use um software de imagem adequado (ou seja, ImageJ) para analisar sinais positivos em seções em termos de distribuição espacial e intensidade do sinal. Para fazer isso, execute as etapas mencionadas abaixo.
- Abra o arquivo com o software ImageJ.
- Clique na imagem > cor > canais divididos a fim de analisar cada canal de cor.
- Clique em Image > stack > projeto Z para obter uma mesclagem de várias aquisições de seção.
- Clique em imagem > cor > Mesclar canais para obter uma mesclagem de canais de cores diferentes da mesma aquisição.
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Solução anticongelante (armazenar a 4 ° c por até 6 meses) |
30% glicerol 30% etileno glicol 30% dH2O amortecedor de fosfato de 10% 2x |
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Solução de bloqueio (Prepare-se no momento) |
Soro normal da cabra de 4% 1% Triton X-100 em solução de lavagem |
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Cryo-Protectant (armazenar a 4 ° c por até 6 meses) |
20% glicerol 80% solução de Sorensen |
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Solução de fosfato de hidrogênio dissódico (loja em RT até 6 meses) |
0.45 m hidrogenofosfato dissódico (Na2HPO4) em dH2O Filtrar em um frasco estéril |
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Solução de lisina (armazenar a 4 ° c por até 3 semanas) |
50% de solução de monocloridrato de L-lisina a 0,3 M 50% de 0,1 M de solução de Sorensen pH 7,6 pH 7,4, filtro em frasco estéril |
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Paraformaldeído (PFA) 8% (Prepare-se a capa das emanações e armazene-o em 4 ° c por até 1 mês) |
2.6 m PFA em dH2O (a 55 ° c _ não exceda 60 ° c filtro em um frasco estéril |
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Tampão fosfato 2x (armazenar a 4 ° c por até 6 meses) |
6% fosfato monossódico (NaH2PO4) solução 45% fosfato dissódico (Na2HPO4) solução em dH2O |
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Solução fixativa PLP (Prepare no momento, a capa das emanações) |
25% paraformaldeído 8% 0.01 m sódio (meta) periodato 75% solução de lisina < |
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Fosfato de sódio monohidrato de dihidrogênio (loja em RT até 6 meses) |
0.52 m sódio dihidrogênio fosfato mono-hidratado (NaH2PO4 * H2O) em dH2O Filtre em uma garrafa estéril. |
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Solução de Sorensen (armazenar a 4 ° c por até 1 mês) |
2,5% solução de fosfato monosódico 18,7% solução de fosfato dissódico pH 7.6, em dH2O |
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Solução de lavagem (Prepare-se no momento) |
base de 0.25 m Trizma 0.26 m NaCl pH 7.6, em dH2O |
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Solução de trabalho (Prepare-se no momento) |
50% solução de bloqueio 50% solução de lavagem |
Tabela 1: Soluções necessárias. Lista de soluções necessárias para o protocolo e breve descrição de como prepará-lo.
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Representative Results
Após o procedimento descrito (Figura 1), foram detectados agregados αsyn, rotulados com anticorpo 5G4, em fascículos do nervo dérmico inervação de estruturas autonômicas de pacientes com DP. A morfologia dos depósitos de alfa-sinucleina aparece como um sinal pontilhado ao longo dos axônios dos nervos dérmicos (Figura 2). De fato, explorando esse protocolo em 19 pacientes com DP e 17 controles em biópsias cutâneas em três sítios anatômicos (cervical, coxa e perna distal), verificou-se que 5G4 tinha 81% de sensibilidade e 86% de especificidade em relação aos controles saudáveis e P-αSyn tinha 56% de sensibilidade e 100% da especificidade19.
Em particular, encontramos 5G4 e P-αSyn depósitos positivos principalmente em nervos em torno de glândulas sudoríparas, mas também no músculo Erector Pili, pequenos vasos, e plexo subepidermal e dérmico, nunca em fibras nervosas intraepidérmicas.
Geralmente, dentro do lúmen da glândula de suor, é possível observar um sinal não específico, que poderia ser mal interpretado como positividade 5G4/P-αSyn. Este tipo de sinal é pontilhado, esférico e é devido mais provavelmente ao material autofluorescente intraluminal, como demonstramos em controles técnicos sem anticorpos primários e secundários (Figura 3). A colocalização com PGP 9.5 que marca as fibras nervosas, que morfologicamente são filamentosas e alongadas, ajuda a identificar o sinal correto. Portanto, a especificidade do sinal 5G4 é altamente aumentada por uma imunocoloração dupla com um marcador axonal (Figura 4).
Uma fixação exata da biópsia é um fator obrigatório para a boa qualidade da coloração da imunofluorescência, e para a interpretação de confiança dos sinais fluorescentes. Se o fixador não estiver corretamente preparado ou se ocorrer uma sobrefixação, o resultado será uma alta autofluorescência que irá mascarar o sinal de fibras nervosas cruzando a junção dérmica-epidérmica ou inervação das principais estruturas dérmicas (Figura 5 B, D, F). Neste caso, a incapacidade de visualizar corretamente as fibras positivas PGP 9.5 tornará difícil analisar corretamente também 5G4.
Finalmente, este protocolo pode ser utilizado para a detecção de qualquer proteína de interesse, incluindo, entre outros, αSyn, P-αSyn ou Tirosina Hidroxilase (TH) e peptídeo intestinal vasoativo (VIP) que marcam respectivamente o subtipo adrenérgico e colinérgico de inervação (Figura 6).
Figura 1 : Representação esquemática do protocolo. Representação gráfica de etapas críticas na fixação, corte e coloração de cortes cutâneos para visualização de agregados αSyn em fibras nervosas periféricas cutâneas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Presença de agregados 5G4 em fibras nervosas dérmicas. Imagens fundidas confocais da Z-pilha da imunofluorescência com PGP 9.5 (verde) e 5G4 (vermelho) de nervos dérmicos em torno das glândulas de suor em pacientes do paládio (A-C) e do assunto saudável (D-F). Este valor é modificado de 19. o visualização 3D da mesma glândula de suor mostrou acima dos assuntos do paládio (G) e do saudável (H). Indicado por setas brancas, colocalização amarela dos dois marcadores ao longo de axônios. Barra de escala = 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Auto-sinais fluorescentes: controles técnicos. Imagens da Z-pilha fundidas Confocal da seção da pele manchadas com DAPI e sem o anticorpo preliminar (a-B), sem o anticorpo secundário (C-D), sem anticorpos preliminares e secundários (e-F). As imagens mostram a presença de sinais pontilhados não específicos nas estruturas das glândulas sudoríparas em todas as condições. Barra de escala = 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Considere a morfologia das fibras nervosas para reconhecer o sinal não específico. Confocal Mesclar imagens Z-Stack de imunofluorescência com PGP 9.5 (verde) e 5G4 (vermelho) de nervos dérmicos em torno de glândulas sudoríparas. As setas brancas indicam estruturas positivas; asteriscos indicam coloração inespecífica em estruturas não neuronais. Barra de escala = 50 μm. Este valor é modificado a partir da referência19. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : A fixação incorreta compromete a qualidade da coloração da imunofluorescência. Imagens da Z-pilha da fusão de Confocal da imunofluorescência com PGP 9.5 (verde) e DAPI (azul) de fibras intraepidérmicas dos nervos (A-B) e de nervos dérmicos em torno da glândula sebáceas (C-D) e das glândulas de suor (e-F). No resultado esquerdo da fixação correta, no resultado direito da fixação excedente. Barra de escala = 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Exemplos de outras proteínas detectáveis nos nervos da pele. Imagens do microscópio das estruturas dérmicas manchadas usando um ensaio de flutuação livre da imunofluorescência. Em vermelho αSyn (A), p-Αsyn (B), e th (C), no VIP verde (D). Barra de escala = 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós descrevemos um ensaio de flutuação livre da imunofluorescência para biópsias da pele para o diagnóstico do paládio: explora a imunocoloração dobro com o anticorpo de anti-PGP 9.5, um marcador panaxonal, e o anti-5G4, um anticorpo específico da conformação que reconheça a forma agregada de αSyn.
As grandes vantagens da biópsia da pele para a finalidade diagnóstica no paládio e possivelmente em outras desordens conformacional da proteína são: 1) o acesso direto ao tecido nervoso propenso à doença por uma técnica suavemente invasora e assim com uma determinação melhor esperada sensibilidade para os agregados αSyn do que líquidos biológicos como o sangue ou o CSF; 2) a oportunidade de detectar e quantificar a densidade da fibra nervosa epidérmica e autonômica como medida de neurodegeneração; 3) a possibilidade de repetição da biópsia cutânea no decorrer do seguimento dos mesmos pacientes, a fim de estudar longitudinalmente a correlação com a progressão da doença.
O protocolo proposto aqui é rápido, versátil e tem poucos passos críticos. Em primeiro lugar, a fixação do tecido tem de ser perseguido corretamente, caso contrário, uma alta auto-fluorescência irá mascarar o sinal específico e impedirá a análise correta dos dados. O paraformaldeído na solução fixativa deve ser feito fresco e pH de 7,4 deve ser verificado com precisão. É extremamente importante evitar a formação de ácido fórmico que pode danificar biópsias. Antes do armazenamento e do corte, se a compacidade da biópsia sugerir uma fixação incorreta, a biópsia deve ser enxaguada novamente com a solução de Sorensen e re-incubado com solução PLP O/N a 4 ° c. Além disso, no início ou no fim do protocolo de coloração da imunofluorescência, algumas etapas adicionais podem ser introduzidas para neutralizar a auto-fluorescência. No início do protocolo (entre as etapas 4,1 e 4,2) um tratamento com solução de borohidreto de sódio (1 mg/mL em TBS; 3 vezes por 10 min), um tratamento com peróxido de hidrogênio (3%; 15 min) ou um tratamento com glicina (0,1 M em TBS; 1h) pode ser realizado. Em alternativa no final da coloração (entre as etapas 4,8 e 4,9), um tratamento com azul de Tripan (250 μg/mL em TBS; 20 min) ou com o Sudão preto (0,5% em 70% EtOH; 30 min) pode ser realizado. No entanto, em todos os casos, além da redução da autofluorescência, também ocorrerá uma redução no sinal específico. Alternativamente, as biópsias incorretamente fixado podem ser usadas para executar o campo brilhante clássico immunohistochemistry. Neste caso, entretanto, a imunomarcação dupla para colocalização de 5G4 e PGP 9.5 será mais desafiadora e difícil de analisar.
Outro passo crítico é a inserção de uma biópsia cutânea no crimolmofo (etapa 3,3). A orientação da biópsia para a lâmina de corte é crucial para a obtenção de fatias nas quais a epiderme e a derme estão presentes. A linha central longitudinal (epiderme-derma) tem que ser paralela à parte inferior do cryomold, de modo que o lado da biópsia, não a parte superior ou a parte inferior, esteja enfrentando o operador. A escolha da espessura das fatias, 50 μm, está de acordo com as diretrizes européias para o uso da biópsia da pele como ferramenta diagnóstica7. Além disso, para uma deteção dos agregados do αSyn, a espessura de 50 μm permite com maior probabilidade ter dentro da seção mais estruturas dérmicas, onde o depósito patológico é encontrado principalmente no paládio. devido à espessura elevada, para ser certo que a seção inteira está tingida, é Não recomendado coloc as seções na corrediça para manchar, mas preferivelmente, uma mancha de flutuação livre é obrigatória. Para este procedimento, a maior dificuldade é transferir as seções de um poço para outro usando um pincel pequeno sem danificar as seções. Recomenda-se inserir a ponta da escova abaixo da biópsia que flutua no líquido, permitindo que a biópsia se estabeleça na ponta da escova, carreg delicadamente a biópsia de um poço a outro, imergir a biópsia na solução nova e remover a escova certificando-se de que nenhum resíduo da biópsia é deixado na escova. É importante que o operador adquira habilidades manuais com prática.
Em conclusão, este é um protocolo curto e fácil para a manipulação óptima e a imunomarcação fluorescente da biópsia da pele. A vantagem deste protocolo em relação aos estudos precedentes é o uso do anticorpo 5G4, permitindo a deteção de agregados pequenos de αSyn pela primeira vez em fibras de nervo autonômicas dérmicas de pacientes do paládio. Pode ser usado potencialmente para finalidades diagnósticas em tipos diferentes de desordens neurodegenerativas que envolvem o PNS, especial em fases adiantadas, quando a cura potencial pode ser a mais eficaz. As limitações do método são que a sensibilidade do P-αSyn e a especificidade de 5G4 são ainda suboptimal mas uma combinação de marcadores diferentes em estudos futuros poderia certamente melhorar o rendimento diagnóstico da biópsia da pele no paládio.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Parkinson Schweiz e ABREOC (o Conselho Consultivo de pesquisa científica do ente Ospedaliero CANTONALE) por seu apoio financeiro deste estudo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2 mg/mL |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2 mg/mL |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
References
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