Summary
Здесь мы представляем протокол для свободно плавающей непрямой иммунофлуоресценции анализ на биопсии кожи разделов, что позволяет для выявления болезни конкретных вариантов конформации альфа-синуклеина, участвующих в болезни Паркинсона и несколько белков периферической нервной системы.
Abstract
На сегодняшний день для большинства нейродегенеративных заболеваний доступна только посмертная гистопатологическая диагностика. Для болезни Паркинсона (PD), диагноз по-прежнему опирается только на клинические признаки двигательной участия, которые появляются позже в течение болезни, когда большинство дофаминергических нейронов уже потеряны. Таким образом, существует острая потребность в биомаркере, который может идентифицировать пациентов в начале заболевания или на риск его развития. За последние несколько лет биопсия кожи оказалась отличным исследовательским и диагностическим инструментом для периферических заболеваний нервов, таких как небольшая клетчатка невропатии. Интересно, что небольшие волокна невропатии и альфа-синуклеин (Зин) нервных отложений были показаны биопсии кожи у пациентов PD. Действительно, биопсия кожи имеет большое преимущество быть легкодоступной, минимально инвазивной и безболезненной процедурой, которая позволяет анализировать периферические нервные ткани, склонные к патологии. Кроме того, возможность повторения биопсии кожи в ходе наблюдения за тем же пациентом позволяет изучать продольную корреляцию с прогрессированием заболевания. Мы создали стандартизированный надежный протокол для исследования наличия агрегатов «Syn» в волокнах нервов кожи пациента PD. Этот протокол включает в себя несколько коротких шагов фиксации, криотомосирование, а затем свободно плавающей иммунофлуоресценции двойное окрашивание с двумя конкретными антителами: анти протеин ген продукт 9.5 (PGP9.5), чтобы отметить кожные нервные волокна и анти 5G4 для обнаружения «Синтез агрегаты. Это универсальный, чувствительный и простой в исполнении протокола, который также может быть применен для ориентации других белков, представляющих интерес для нервов кожи. Способность маркировать агрегаты «Syn» является еще одним шагом вперед к использованию биопсии кожи в качестве инструмента для установления предсмертной гистопатологической диагностики PD.
Introduction
Биопсия кожи приобрела большое значение в качестве диагностического иисследовательского инструмента в области неврологических расстройств 1. Действительно, эпидермис и дерма содержат обильные соматические сенсорные нервные волокна (миелинированные и немиелинированные), ноцицептивные свободные нервные окончания, сенсорные рецепторы и вегетативную инвенвацию потовых желез, сосудов, сальных желез и мышечных арфистых пилорумов 2.
В середине 20-го века, установка для иммуногистохимии PGP9.5 антитела позволили доказательства обширной иннервации человеческой эпидермис кожи млекопитающих3. PGP9.5 представляет собой карбоксило-терминальную гидролазу, равномерно распределенную по аксонам как центральной, так и периферической нервной системы (PNS). Наличие этого антитела позволило не только прояснить морфологию и анатомию PNS в коже, но и внедрить исследование заболеваний, связанных с ней3,4. Биопсия кожи способствовала определению новой клинической сущности: мелкой клетчатки невропатии. Несколько международных групп продемонстрировали связь между потерей интраэпидермальных нервных волокон и симптомами/признаками мелкой клетчатки невропатии5 анализом биопсии кожи и предоставили стандартизированные протоколы для нервной морфометрии, а также нормативные эталонные значения, которые будутиспользоваться в клинической практике 6,7,8.
В последнее время большое количество доказательств показало, что нейродегенеративные заболевания, характеризующиеся неправильно сложенными накоплениями белка в центральной нервной системе, являются многосистемными патологиями9. Действительно, PD характеризуется накоплением син в дофаминергическом нейроне substantia nigra,но было продемонстрировано, что «Син и его патологическая форма, фосфорилированный син (P-'Syn), могут быть обнаружены также в периферических тканях. гастро-кишечная слизистая оболочка10, слюнные железы11, кожа вегетативных волокон, окружающих потовые железы и пиломоторные мышцы12,13,14, показать иммунореактивность к патогенным формам Syn, в в соответствии с гипотезой Браак, что интригующе постулировать, что патология syn может начаться в PNS заблаговременно, до его накопления в мозге15. Кроме того, наличие р-Зсин было продемонстрировано в кожных нервах пациентов с расстройствами поведения REM, которые считаются продромальными PD16,17 таким образом, патологический кожный синтез можно считать перспективным ранним периферическим гистопатологический маркер синуклейнопатии.
Связь мелкого волокна невропатии в PD было продемонстрировано ранее, и было установлено, что интраэпидермальные нервные волокна плотность отражает прогрессирование заболевания18,19. Таким образом, биопсия кожи является полезным инструментом для изучения нейродегенерации в PD и для установления досмертной гистопатологической диагностики заболевания. Действительно, биопсия кожи имеет большое преимущество в том, что легко доступная и минимально инвазивная процедура, позволяющая анализировать нервную ткань, склонную к патологии. Наконец, возможность повторения биопсии кожи в ходе наблюдения за теми же пациентами позволяет изучать продольную корреляцию с прогрессированием заболевания.
В нашей лаборатории, используя двойное иммуно-окрашивание с PGP9.5 и конформации конкретных моноклональных 5G4 антитела, что признает болезни конкретных форм "Syn в том числе малых агрегатов20,21, мы смогли показать наличие агрегатов «Syn» в кожных нервах с перспективной высокой диагностической эффективностью19. Иммунофлуоресценция анализ биопсии кожи при конформационных заболеваниях выделяется как перспективный источник биомаркеров, сочетая как обнаружение белковых агрегатов, так и меру нейродегенерации в vivo. Далее мы иллюстрируем простой и универсальный протокол по обработке биопсии кожи и выполнению свободно плавающего иммунофлуоресцентного окрашивания для обнаружения агрегатов Syn. Кроме того, этот протокол может быть адаптирован для ориентации любого другого белка, интересуемого в коже PNS.
Следующий протокол исследования был использован для оценки диагностической полезности агрегированного анализа Syn в PNS PD по биопсии кожи19. Критерии включения для PD были: определенный клинический диагноз в соответствии с диагностическими критериями Банка мозга Великобритании, продолжительность заболевания по крайней мере 3 лет, нет семейной истории, и никаких серьезных когнитивных нарушений или основных дистоветномических симптомов в истории. Критериями исключения были известны причины невропатии (гликированный гемоглобин, креатинин, витамин В12, ТТГ, иммунофиксация сыворотки, ВИЧ, ВГС, сифилис и боррелиоз). Каждый предмет прошел 3 мм-диаметр биопсии кожи на трех анатомических участках (шея на дерматомном уровне C8, бедро 10 см выше колена, нога 10 см выше боковой malleolus) на стороне, которая была клинически более пострадавших. В целом, следующий протокол об обработке биопсии кожи и выполнения свободно плавающей иммунофлуоресцентности окрашивания и анализа. Поэтому его можно адаптировать и использовать для обнаружения других белков, представляющих интерес в тканях кожи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол был одобрен Кантональным комитетом по этике, и все зачисленные субъекты дали письменное информированное согласие на исследование.
1. Коллекция биопсии кожи
- Пусть квалифицированный врач выполняет биопсию кожи в соответствующих клинических условиях.
- Выберите область для выполнения биопсии кожи и очистить его с алкоголем тампон.
- Приготовьте обезостереженое раствор с 1 кубиком лидокаина 2%.
- С иглой параллельно области, вводят местную анестезию подкожно.
- После проверки эффекта анестезии, принять 3 мм одноразовый пунш и применять вращательное и деликатное понижательное давление, чтобы повернуть его вниз через эпидермис и дерму, пока подкожный жир достигается.
- Сними удар.
- Используйте одноразовые щипки, чтобы аккуратно вытащить кожу подключите.
- Используйте ножницы, чтобы вырезать основание образца на уровне жировой ткани.
- Поместите образец в трубку, содержащую 10 мл фиксаторного раствора периодии-лизина-параформальдегида (ПЛП).
- Дезинфицировать область и покрыть его клейкой повязкой.
2. Исправление и хранение тканей
- Сделать свежий PLP фиксаторное решение (см. Таблица 1).
- Сразу же после сбора биопсии кожи, погрузить его в трубку, содержащую 10 мл plP фиксаторного раствора и инкубировать его на ночь (O / N) при 4 градусах Цельсия.
- На следующий день после этого, под дымом капот, удалить PLP фиксатор мягко и в той же трубке, мыть биопсии 3 раза в течение 5 мин с 5 мл 0,1 М Растворсен раствор (Таблица 1).
- Откажитесь от раствора Соренсена и инкубируйте биопсию 5 мл криозащитного раствора O/N при 4 градусах Цельсия.
- Храните биопсию при 4 градусах Цельсия, если разрез с криотомом выполняется в течение 1 недели; хранить биопсию при -20 градусах Цельсия, если разрез выполняется в течение 3 месяцев; вставлять биопсию в криомольд (шаги 3.2-3.4) и хранить его при -80 градусах По Цельсию, чтобы сохранить ее в течение более длительного периода времени.
3. Ткань вырезать с криотомом
- Установите криотомо на уровне -20 градусов.
- Возьмите криомолд и заполните его крио-встраивающей средой. Избегайте создания пузырьков.
- Использование пинцета погружайте биопсию в крио-встраивающую среду с продольной оси (эпидермис - дерма) параллельно нижней части криомолда.
- Привязать заморозить образец с жидким азотом для получения твердого куба крио-встраивательных среды, содержащей биопсии в правой ориентации.
- Положите образец в криостат и подождите 30 минут, чтобы биопсия акклиматизировалась.
- Зафиксните образец на криостате и вырежьте 50 мкм секций.
- С помощью небольшой кисти, передача крио-секций в 96 хорошо пластины, содержащие 200 зл. раствор антифриза в каждом колодце. Один раздел на скважину.
- Хранить при -20 градусах по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если анализировать всю биопсию не анализируется, вырежьте ее лишь частично. В этом случае секции должны храниться при -20 градусах Цельсия, а остальная часть биопсии - при -80 градусов по Цельсию, чтобы сохранить ее в течение более длительного периода времени.
4. Иммунофлуоресценция окрашивание
- Заполните 96 хорошо пластины, с 100 л стирального раствора.
- Перенесите секции для анализа с тарелки на новую, содержащую стиральный раствор. 1 секция на каждую скважину (4 секции на анатомический участок, на одного пациента: обычно в общей сложности 12 секций на пациента).
- Оставьте секцию в стиральном растворе на 10 мин при комнатной температуре (RT). Перенесите секцию в другой колодец, содержащий тот же раствор, и повторите стирку.
- Переместите секции в новые скважины, содержащие 100 qL блокирующего раствора и инкубировать, по крайней мере 90 мин и не более 4 ч на RT.
- Разбавить первичные антитела анти-PGP9.5 (Кролик поликлональный, 1:1000) и анти-5G4 (Мышь моноклональной, 1:400) в рабочем растворе.
- Перенесите секции в новые скважины, содержащие 100 зЛ рабочего раствора первичных антител и инкубировать их O/N на РТ.
- В качестве шага 4.3, мыть разделы 2 раза, по крайней мере 10 мин на RT, с 100 зл стирки раствора.
- Разбавить вторичные антитела (конъюгированные с различными флюорофорами) Коза анти-Кролик для обнаружения PGP9.5 (1:700) и Коза анти-мышь для обнаружения 5G4 (1:700) в рабочем решении.
- Перенесите секции в новые скважины, содержащие 100 зЛ рабочего раствора вторичных антител на 90 мин на РТ. С этого момента, покрыть 96 хорошо пластины с алюминиевой фольгой, чтобы избежать отбеливания фторфора сопряжены со вторичными антитела / ies.
- В качестве шага 4.3, мыть разделы 2 раза, по крайней мере 10 мин, с 100 зл стирки раствора.
- Перенесите секции в новые скважины, содержащие 100 зл DAPI (разбавленные 1:5,000 в PBS 1x) в течение 5 минут на RT.
- В качестве шага 4.3, мыть разделы 2 раза, по крайней мере 10 мин, с 100 зл стирки раствора.
- Установите секции на слайде в правильном положении, избегая неправильного сворачивания.
- Добавьте несколько капель монтажной среды на слайд и накройте крышкой.
- Пусть слайды сухой O / N перед использованием конфокальный / флуоресцентный микроскоп.
- Храните слайды в соответствующей коробке при 4 градусах По Цельсию, избегая воздействия света. При точном хранении сигнал будет виден в течение 6 месяцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Передача секции из пластины 96 скважин, содержащей недавно нарезанные ломтики, на пластину 96 скважин, содержащую стиральный раствор (шаг 4.1), осуществляется с помощью небольшой кисти, которая помогает подобрать биопсию. После переноса секции в первый колодец, каждый раз, когда срез должен быть инкубирован другим раствором, перемещайте его из колодца в колодец с помощью кисти.
5. Иммунофлуоресценция
- Просмотр разделов под перевернутым флуоресцентным микроскопом или конфокальный микроскоп (20X, 40x или выше увеличения, используйте последовательные кадры с шагом в 2 мкм на плане стек для достижения наилучших результатов).
- Приобретение изображений с помощью подключенной к микроскопу камеры
-
Используйте адекватное программное обеспечение для визуализации (т.е. ImageJ) для анализа положительных сигналов в разделах с точки зрения пространственного распределения и интенсивности сигнала. Для этого выполните шаги, упомянутые ниже.
- Откройте файл с помощью программного обеспечения ImageJ.
- Нажмите на изображение , цвет
- Нажмите Изображение и стек и стек, чтобы получить слияние нескольких приобретений раздела.
- Нажмите изображение
|
Решение антифриза (хранить при 4 градусах по Цельсию до 6 месяцев) |
30% Глицерол 30% этиленгликоль 30% dH2O 10% 2x фосфатный буфер |
|
Блокирующее решение (подготовьтесь в данный момент) |
4% Нормальная коза сыворотка 1% Тритон X-100 в стиральном растворе |
|
Крио-защита (хранить при 4 градусах по Цельсию до 6 месяцев) |
20% Глицерол 80% решение Соренсена |
|
Раствор фосфата водорода динатрия (хранить на RT до 6 месяцев) |
0.45M Фосфат водорода динатрия (Na2HPO4) в dH2O Фильтр в стерильной бутылке |
|
Лизинское решение (хранить при 4 градусах по Цельсию в течение 3 недель) |
50% раствор моногидрохлорида 0,3 МЛ-лизин 50% от решения 0.1M Соренсена pH7.6 pH 7.4, фильтр в стерильной бутылке |
|
Параформальдегид (PFA) 8% (подготовьте под капотом дыма и храните при 4 градусах По Цельсия до 1 месяца) |
2.6M PFA в dH2O (до 55 градусов по Цельсию, чтобы фильтр в стерильной бутылке |
|
Фосфат буфер 2x (хранить при 4 градусах по Цельсию до 6 месяцев) |
6% Раствор фосфата натрия monosodium (NaH2PO4) 45% Раствор фосфата динатрия (Na2HPO4) в dH2O |
|
Фиксаторное решение PLP (подготовьте на данный момент, под дымом капот ) |
25% Параформальдегид 8% 0.01M Натрий (мета)период 75% Лизинское решение; |
|
Дигидроген дигидроген Моногидрат (хранить на RT до 6 месяцев) |
0.52M натрия диводород фосфат моногидрат (NaH2PO4'H2O) в dH2O Фильтр в стерильной бутылке. |
|
Решение Соренсена (хранить при 4 градусах по Цельсию до 1 месяца) |
2.5% Раствор фосфата натрия мононатрия 18.7% Раствор фосфата динатрия pH7.6, в dH2O |
|
Стиральная раствор (подготовьтесь в данный момент) |
0.25M база Трицма 0.26M NaCl pH7.6, в dH2O |
|
Рабочее решение (подготовьтесь в данный момент) |
50% Блокирующее решение 50% Стиральная раствор |
Таблица 1: Необходимые решения. Список необходимых решений для протокола и краткое описание того, как его подготовить.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Следуя описанной процедуре(Рисунок 1), мы обнаружили ,Syn агрегаты, помеченные 5G4 антитела, в дермальных нервных фасциклов иннерватирования вегетативных структур PD пациентов. Морфология альфа-синуклеина появляется как пунктирный сигнал вдоль аксонов дермальных нервов(рисунок 2). Действительно, используя этот протокол в 19 PD пациентов и 17 контроля в биопсии кожи на трех анатомических сайте (шейка матки, бедра и дистальной ноги) мы обнаружили, что 5G4 было 81% чувствительности и 86% от специфичности уважения к здоровому контролю и P-'Syn было 56% чувствительности и 100% специфичности19.
В частности, мы обнаружили 5G4 и P-SSyn положительные отложения в основном в нервах вокруг потовых желез, но и в мышцах erector pili, мелкие сосуды, и субэпидермальные и дермальные сплетения, никогда в интраэпидермальных нервных волокон.
Как правило, в просвете потовой железы можно наблюдать неспецифический сигнал, который может быть неправильно истолкован как позитив 5G4/ P-'Syn. Этот тип сигнала пунктирный, сферический и это связано, скорее всего, с внутрилюминовенным автоматическим флуоресцентным материалом, как мы продемонстрировали в техническом управлении без первичных и вторичных антител(рисунок 3). Совместное локализация с PGP9.5, которая отмечает нервные волокна, которые морфологически являются нитевидными и удлиненные, помогает определить правильный сигнал. Таким образом, специфичность сигнала 5G4 значительно увеличивается на двойное иммунопятно с аксональным маркером(рисунок 4).
Точная фиксация биопсии является обязательным фактором для хорошего качества окрашивания иммунофлюоресценции, а также для надежной интерпретации флуоресцентных сигналов. Если фиксатор не правильно подготовлен или если произошло чрезмерное фиксация, результатом будет высокая автофлуоресценция, которая замаскирует сигнал нервных волокон, пересекающих дермально-эпидермальный узел или иннерват основных кожных конструкций (Рисунок 5 B, D, F). В этом случае, неспособность правильно визуализировать PGP9.5 положительных волокон будет трудно правильно анализировать также 5G4.
Наконец, этот протокол может быть использован для обнаружения любого белка, представляющих интерес, в том числе, в частности, «Syn, P-»Syn или тирозин гидроксилаза (TH) и вазоактивный кишечный пептид (VIP), которые отмечают соответственно андренерический и холинергический подтип вегетативных иннервация(рисунок 6).
Рисунок 1 : Схематическое представление протокола. Графическое представление критических шагов в фиксации, вырезать и окрашивание секций кожи для визуализации qSyn агрегатов в кожных периферических нервных волокон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Наличие агрегатов 5G4 в кожных нервных волокнах. Конфокальный слил изображения иммунофлуоресценции с PGP9.5 (зеленый) и 5G4 (красный) кожных нервов вокруг потовых желез у пациентов PD (A-C) и здоровый предмет (D-F). Эта цифра изменена с 19. 3D визуализация той же потовой железы показали выше от PD (G) и здоровых (H) субъектов. Показаны белыми стрелками, желтый colocalization 2 маркеров вдоль аксонов. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Автофлуоресцентные сигналы: техническое управление. Confocal слил изображения кожи, окрашенные DAPI и без первичного антитела (A-B), без вторичного антитела (C-D), без первичных и вторичных антител (E-F). На снимках видно наличие неспецифических пунктирных сигналов в структурах потовых желез в всех условиях. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Рассмотрим морфологии нервных волокон, чтобы распознать неспецифический сигнал. Конфокальные сливаются изображения иммунофлуоресценции с PGP9.5 (зеленый) и 5G4 (красный) дермальных нервов вокруг потовых желез. Белые стрелки указывают на положительные структуры; звездочки указывают на неспецифическое окрашивание в ненейронные структуры. Шкала бар 50 мкм. Эта цифра изменена из ссылки19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 : Неправильная фиксация ставит под угрозу качество окрашивания иммунофлюоресценции. Конфокальный слияние стеков изображений иммунофлуоресценции с PGP9.5 (зеленый) и DAPI (синий) внутриэпидальных волокон нервов (A-B) и дермальных нервов вокруг сальных желез (C-D) и потовых желез (E-F). Слева результат правильной фиксации, на правом результате чрезмерной фиксации. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6 : Примеры других белков, обнаруживаемых в кинах нервов. Микроскоп изображения кожных структур окрашенных с помощью свободно плавающей иммунофлуоресценции анализ. В красном SSyn (A), р-Зсин (B), и TH (C), в зеленом VIP (D). Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описываем свободно плавающий иммунофлуоресценционный анализ биопсии кожи для диагностики PD: он использует двойное иммуносохранение с анти-PGP9.5 антитела, panaxonal маркер, и анти-5G4, конформации конкретных антител, который признает агрегированной форме из «Син».
Большие преимущества биопсии кожи для диагностических целей в PD и, возможно, в других белковых конформанформальных расстройств являются: 1) прямой доступ к нервной ткани склонны к болезни с легкаю инвазивной техникой и, таким образом, с ожидаемым лучшим определением чувствительность к агрегатам ,Syn, чем биологические жидкости, такие как кровь или CSF; 2) возможность обнаружения и количественной оценки эпидермальной и вегетативной плотности нервных волокон как меры нейродегенерации; 3) возможность повторения биопсии кожи в ходе наблюдения за теми же пациентами, для того, чтобы изучить продольно корреляцию с прогрессированием заболевания.
Предложенный здесь протокол является быстрым, универсальным и имеет несколько критических шагов. Прежде всего, фиксация тканей должна быть продолжена правильно, иначе высокая автофлуоресценция замаскирует специфический сигнал и предотвратит правильный анализ данных. Параформальдегид в фиксаторном растворе должен быть свежим, а рН 7,4 следует точно проверять. Чрезвычайно важно избегать образования формовозной кислоты, которая может повредить биопсию. Перед хранением и разрезом, если компактность биопсии предполагает неправильную фиксацию, биопсия должна быть снова промыта раствором Соренсена и повторно инкубирована раствором PLP O/N при 4 градусах Цельсия. Кроме того, в начале или в конце протокола окрашивания иммунофлуоресценции, несколько дополнительных шагов могут быть введены для противодействия автофлуоресценции. В начале протокола (между шагами 4.1 и 4.2) можно провести лечение раствором борогидрида натрия (1 мг/мл в ТБС; 3 раза за 10 мин), лечение перекисью водорода (3%; 15 мин) или лечение глицином (0,1 М в ТБС; 1ч). В качестве альтернативы в конце окрашивания (между шагами 4,8 и 4,9), лечение трипан синий (250 мкг/мл в TBS; 20 мин) или с Суданом Черный (0,5% в 70% EtOH; 30 мин) может быть выполнена. Однако во всех случаях, помимо снижения автофлуоресценции, также произойдет снижение конкретного сигнала. Кроме того, неправильно зацикленные биопсии могут быть использованы для выполнения классической яркой иммуногистохимии поля. В этом случае, однако, двойное иммунопятно для колокализации 5G4 и PGP9.5 будет более сложным и трудным для анализа.
Другим важным шагом является введение биопсии кожи в криомольд (шаг 3.3). Ориентация биопсии на резку имеет решающее значение для получения ломтиков, в которых присутствуют эпидермис и дермы. Продольная ось (эпидермис-дерма) должна быть параллельно нижней части криомолда, так что сторона биопсии, а не сверху или снизу, сталкивается с оператором. Выбор ломтиков толщиной, 50 мкм, в соответствии с европейскими руководящими принципами для использования биопсии кожи в качестве диагностического инструмента7. Кроме того, для обнаружения агрегатов «Syn» толщина 50 мкм позволяет с большей вероятностью иметь в секции более кожные структуры, где патологические отложения в основном находятся в PD. Из-за высокой толщины, чтобы быть уверенным, что весь раздел окрашен, это не рекомендуется размещать разделы на слайде для окрашивания, но вместо этого, свободно плавающие окрашивания является обязательным. Для этой процедуры основной сложностью является перенос секций из одного колодца в другой с помощью небольшой кисти, не повреждая секции. Рекомендуется вставить кончик кисти ниже биопсии, которая плавает в жидкости, что позволяет биопсии осесть на кончике кисти, осторожно нести биопсию из одного колодца в другой, погрузить биопсию в новое решение и удалить кисть убедившись, что на кисти не остается остатков биопсии. Важно, чтобы оператор прививыл ручные навыки с практикой.
В заключение, это короткий и легкий протокол для оптимальной обработки и флуоресцентного иммуносиндиинства биопсии кожи. Преимуществом этого протокола по сравнению с предыдущими исследованиями является использование антител 5G4, что позволяет впервые обнаружить небольшие агрегаты в кожных вегетативных нервных волокнах пациентов PD. Он может быть потенциально использован для диагностических целей в различных типах нейродегенеративных расстройств с участием PNS, особенно на ранних стадиях, когда потенциальное лечение может быть наиболее эффективным. Ограничения метода заключается в том, что чувствительность P-SSyn и специфичность 5G4 все еще неоптимальны, но сочетание различных маркеров в будущих исследованиях, безусловно, может улучшить диагностический выход биопсии кожи в PD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Паркинсона Швейза и ABREOC (Консультативный совет по научным исследованиям Кантонале Энте Оспедедеро) за финансовую поддержку этого исследования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2 mg/mL |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2 mg/mL |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
References
- McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist's Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
- Wilkinson, P. F., Millington, R. Skin. , Cambridge University Press. Cambridge. ISBN 978-0-521-10681-8 49-50 (2009).
- Weddell, G., et al.
- Wang, L., et al. Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin. Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).
- Holland, N. R., et al. Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy. Neurology. 48, 708-711 (1997).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).
- Provitera, V., et al. A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg. European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).
- Wakabayashi, K., et al. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).
- Ruffmann, C., et al. Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease. Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).
- Lee, J. M., et al. The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).
- Donadio, V., et al. Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease. Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).
- Doppler, K., et al. Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology. Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).
- Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy. Brain. 138, 2310-2321 (2015).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).
- Doppler, K., et al. Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease. Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).
- Antelmi, E., et al. Skin nerve phosphorylated α-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder. Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).
- Nolano, M., et al. Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study. Acta Neuropathologica. , (2018).
- Melli, G., et al. Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).
- Kovacs, G. G., et al. Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread. Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).
- Kovacs, G. G., et al. An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology. Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).
