Isolatie van Myo cellen van volwassen muizen traan en submandibulaire klieren
Summary
De traanklier (LG) heeft twee soorten cellen uitdrukken α-Smooth spier actine (αSMA): Myo cellen (MECs) en pericyten. MECs zijn van ectodermale oorsprong, gevonden in vele klier weefsels, terwijl pericyten zijn vasculaire gladde spiercellen van endodermal oorsprong. Dit protocol isoleert MECs en pericyten van muizen LGs.
Abstract
De traanklier (LG) is een exocriene tubuloacinar klier die een waterige laag van traanfilm afscheidt. De LG epitheel boom bestaat uit acinaire, ductale epitheel, en Myo cellen (MECs). MECs Express alpha Smooth spier actine (αSMA) en hebben een samentrekbaar functie. Ze zijn te vinden in meerdere klier organen en zijn van ectodermale oorsprong. Bovendien, de LG bevat SMA + vasculaire gladde spiercellen van endodermal oorsprong genaamd pericyten: samentrekbaar cellen die envelop het oppervlak van vasculaire buizen. Een nieuw protocol stelt ons in staat om zowel MECs en pericyten te isoleren van volwassen muizen LGs en submandibulaire klieren (SMGs). Het protocol is gebaseerd op de genetische etikettering van MECs en pericyten met behulp van de SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatoFL/FL muis stam, gevolgd door de voorbereiding van de LG single-cell schorsing voor FLUORESCENTie geactiveerd cel sorteren (FACS ). Het protocol zorgt voor de scheiding van deze twee cellen populaties van verschillende oorsprong op basis van de expressie van de epitheel cel adhesie molecuul (EpCAM) door MECs, terwijl pericyten niet Express EpCAM. Geïsoleerde cellen kunnen worden gebruikt voor cel teelt of Genexpressieanalyse.
Introduction
Myo cellen (MECs) zijn aanwezig in vele exocriene klieren, waaronder traan, speeksel, harderian, zweet, prostaat, en de borst. MECs zijn een uniek type cel dat een epitheel en een glad spier fenotype combineert. MECs Express α-Smooth spier actine (SMA) en hebben een samentrekbaar functie1,2. In aanvulling op MECs, de traanklier (LG) en de submandibulaire klier (SMG) bevat SMA + vasculaire cellen genaamd pericyten, die cellen van endodermal oorsprong die envelop het oppervlak van vasculaire buizen3. Hoewel MECs en pericyten Express veel markers, SMA is de enige marker die niet wordt uitgedrukt in andere LG en SMG cellen1,3.
In de laatste 40 jaar rapporteerden verschillende laboratoria analyses voor de dissociatie van verschillende exocriene klier weefsels, waarbij niet-enzymatische en enzymatische benaderingen werden toegepast. In één van de eerste rapporten die in 1980 worden gepubliceerd, beschreven Fritz en coauteurs een protocol om katachtige parotis acini te isoleren gebruikend opeenvolgende spijsvertering in een Collagenase/trypsine oplossing4. In 1989, Hann en coauteurs aangepast dit protocol voor acini isolatie van Rat LGs met behulp van een mengsel van Collagenase, hyaluronidase en DNase5. In 1990, Cripps en collega’s publiceerde de methode van niet-enzymatische dissociatie van traanklier acini6. Later, in 1998, Zoukhri en coauteurs terug naar een enzymatische dissociatie protocol voor het opvolgen van CA2 +-Imaging op LG en SMG geïsoleerde acini7. Binnen het laatste decennium, hebben de onderzoekers hun nadruk op isolatie van stam/voorlopercellen van exocriene klieren gedraaid. Pringle en coauteurs beschreven een protocol in 2011 voor de isolatie van de muis SMG stamcellen8. Deze methode werd gebaseerd op isolatie van stamcellen-bevattende salispheres, die in cultuur werden gehandhaafd. De auteurs beweerden dat de proliferatie cellen die stamcel-geassocieerde markers uitdrukken van deze salispheres8zouden kunnen worden geïsoleerd. Shatos en coauteurs publiceerden het protocol voor de isolatie van de voorganger cel van ongewonde volwassen rat LGs gebruikend enzymatische spijsvertering en het verzamelen van “bevrijd” cellen9. Later, in 2015, Ackermann en coauteurs aangepast deze procedure te isoleren vermoedelijke “muizen traanklier stamcellen” (“mLGSCs”) die kunnen worden gepropageerd als een mono-Layer cultuur over meerdere passages10. Echter, geen van de eerder genoemde procedures toegestaan voor het onderscheiden van cellulaire subtypen en individuele populaties van geïsoleerde epitheelcellen. In 2016, Gromova en coauteurs publiceerde een procedure voor de isolatie van de stem van LG/stamvader cellen van volwassen muizen LGs met behulp van FACS11. Dit protocol was echter niet bedoeld om MECs te isoleren.
Onlangs hebben we aangetoond dat we in staat zijn om SMA + cellen isoleren van 3 week-oude SMA-GFP muizen12. Echter, op dit moment hebben we niet gescheiden verschillende populaties van SMA + cellen. Hier vestigden wij een nieuwe procedure voor de directe isolatie van onderscheiden MECs en pericyten van volwassen LGs en SMGs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit manuscript beschreef een protocol van MEC en pericyte isolatie van LG en SMG. Deze procedure was gebaseerd op genetische etikettering van SMA, de enige betrouwbare biomarker van MECs en pericyten.
De urgentie om dit protocol te ontwikkelen werd gemotiveerd door de bijna totale afwezigheid van literatuur die de isolatie van MECs van muizen LGs en SMGs benadrukt. Hoewel de genetische etikettering eerder werd gebruikt, gebruikend SMA-GFP muizen om SMA + cellen van jonge drie-week-oude LGs<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Ivo Kalajzic voor het verstrekken van ons met de SMACreErt2 muis stam, Tok Umazume voor muis staart en genotypen, Mark Shelley voor het verwerven van professionele Foto’s voor figuur 2. Wij danken ook Scripps Raad van wetenschappelijke redactie en Mark Shelley voor wetenschappelijke Engels bewerken. Wij zijn dankbaar voor de Scripps Research Institute flow Cytometry core voor hulp bij het sorteren van cellen en Dr Robin Willenbring voor meerdere discussies/advies over FACS data-analyse.
Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid, het nationale Instituut van het oog verleent 5 R01 EY026202 en 1 R01 EY028983 aan H.P.M.
Materials
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 ml Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1000mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
- Makarenkova, H. P., Dartt, D. A. Myoepithelial Cells: Their Origin and Function in Lacrimal Gland Morphogenesis, Homeostasis, and Repair. Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 115-123 (2015).
- Haaksma, C. J., Schwartz, R. J., Tomasek, J. J. Myoepithelial cell contraction and milk ejection are impaired in mammary glands of mice lacking smooth muscle alpha-actin. Biology Of Reproduction. 85 (1), 13-21 (2011).
- Siedlecki, J., et al. Combined VEGF/PDGF inhibition using axitinib induces alphaSMA expression and a pro-fibrotic phenotype in human pericytes. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. , (2018).
- Fritz, M. E., LaVeau, P., Nahmias, A. J., Weigel, R. J., Lee, F. Primary cultures of feline acinar cells: dissociation, culturing, and viral infection. American Journal of Physiology. 239 (4), G288-G294 (1980).
- Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 145-158 (1989).
- Cripps, M. M., Bromberg, B. B., Bennett, D. J., Welch, M. H. Structure and function of non-enzymatically dissociated lacrimal gland acini. Current Eye Research. 10 (11), 1075-1080 (1991).
- Zoukhri, D., Hodges, R. R., Rawe, I. M., Dartt, D. A. Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1-adrenergic agonists is up-regulated in lacrimal and submandibular glands in a murine model of Sjogren’s syndrome. Clinical Immunology and Immunopathology. 89 (2), 134-140 (1998).
- Pringle, S., Nanduri, L. S., van der Zwaag, M., van Os, R., Coppes, R. P. Isolation of mouse salivary gland stem cells. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Ackermann, P., et al. Isolation and Investigation of Presumptive Murine Lacrimal Gland Stem Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Gromova, A., et al. Lacrimal Gland Repair Using Progenitor Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2017).
- Hawley, D., et al. Myoepithelial cell-driven acini contraction in response to oxytocin receptor stimulation is impaired in lacrimal glands of Sjogren’s syndrome animal models. Scientific Reports. 8 (1), 9919 (2018).
- Matic, I., et al. Quiescent Bone Lining Cells Are a Major Source of Osteoblasts During Adulthood. Stem Cells. 34 (12), 2930-2942 (2016).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Eckhard, U., Schonauer, E., Brandstetter, H. Structural basis for activity regulation and substrate preference of clostridial collagenases. G, H, and T. Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20184-20194 (2013).
- Breggia, A. C., Himmelfarb, J. Primary mouse renal tubular epithelial cells have variable injury tolerance to ischemic and chemical mediators of oxidative stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 1 (1), 33-38 (2008).
- Mueller, S. O., Clark, J. A., Myers, P. H., Korach, K. S. Mammary gland development in adult mice requires epithelial and stromal estrogen receptor alpha. Endocrinology. 143 (6), 2357-2365 (2002).
- Guthmiller, J. J., Zander, R. A., Butler, N. S. Measurement of the T Cell Response to Preerythrocytic Vaccination in Mice. Methods in Molecular Biology. 1325, 19-37 (2015).
- Seime, T., et al. Inducible cell labeling and lineage tracking during fracture repair. Development, Growth & Differentiation. 57 (1), 10-23 (2015).
- Hawley, D., et al. RNA-Seq and CyTOF immuno-profiling of regenerating lacrimal glands identifies a novel subset of cells expressing muscle-related proteins. PLoS One. 12 (6), e0179385 (2017).
- Tata, A., et al. Myoepithelial Cells of Submucosal Glands Can Function as Reserve Stem Cells to Regenerate Airways after Injury. Cell Stem Cell. 22 (5), 668-683 (2018).
- Song, E. C., et al. Genetic and scRNA-seq Analysis Reveals Distinct Cell Populations that Contribute to Salivary Gland Development and Maintenance. Scientific Reports. 8 (1), 14043 (2018).
- Knight, A. n. d. r. e. w. W., B, N. Distinguishing GFP from cellular autofluorescence. Biophotonics International. 8 (7), 7 (2001).
- Januszyk, M., et al. Evaluating the Effect of Cell Culture on Gene Expression in Primary Tissue Samples Using Microfluidic-Based Single Cell Transcriptional Analysis. Microarrays (Basel). 4 (4), 540-550 (2015).
