成人ネズミ涙腺および顎下腺からの筋上皮細胞の単離
Summary
涙腺 (LG) は、α平滑筋アクチン (αSMA): 筋上皮細胞 (MECs) および周皮細胞を発現する2つの細胞型を有する。MECs は外胚葉の起源であり、多くの腺組織に見られる一方、周皮細胞は endodermal 起源の血管平滑筋細胞である。このプロトコルは、マウス LGs から MECs および周皮細胞を分離する。
Abstract
涙腺 (LG) は、涙液膜の水性層を分泌する外分泌 tubuloacinar 腺である。LG 上皮樹は、腺房、導管上皮、および筋上皮細胞 (MECs) で構成されています。MECs は、アルファ平滑筋アクチン (αSMA) を発現し、収縮機能を有する。それらは、複数の腺器官で発見され、外胚葉の起源である。さらに、LG には、血管管の表面を囲む収縮細胞で周皮細胞と呼ばれる endodermal 起源の SMA + 血管平滑筋細胞が含まれています。新しいプロトコルは、私たちは大人ネズミ LGs と顎下腺 (SMGs) から MECs と周皮細胞の両方を分離することができます。プロトコルは、 SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl マウス株を使用して MECs および周皮細胞の遺伝的標識に基づいており、続いて蛍光活性化細胞選別用の LG 単細胞懸濁液の調製 (FACS).このプロトコルは、MECs による上皮細胞接着分子 (EpCAM) の発現に基づいて異なる起源のこれら2つの細胞集団を分離することを可能にし、一方、周皮細胞は EpCAM を発現しない。分離した細胞は、細胞培養や遺伝子発現解析に使用できます。
Introduction
筋上皮細胞 (MECs) は、涙腺、唾液、harderian、汗、前立腺、および乳腺を含む多くの外分泌腺に存在する。MECs は、上皮と平滑筋の表現型を兼ね備えたユニークな細胞タイプです。MECs は、α平滑筋アクチン (SMA) を発現し、収縮機能1,2を有する。MECs に加えて、涙腺 (LG) および顎下腺 (SMG) には、血管管3の表面を包み込む endodermal 起源の細胞である周皮細胞と呼ばれる SMA + 血管細胞が含まれている。MECs と周皮細胞は多くのマーカーを発現するが、SMA は他の LG および SMG 細胞1、3で発現されていない唯一のマーカーである。
過去40年以内に、いくつかの研究所では、非酵素的および酵素学的アプローチが適用された異なる外分泌腺組織の解離のためのアッセイを報告した。1980に発表された最初の報告の1つにおいて、フリッツと共同編集者は、コラゲナーゼ/トリプシン溶液4において逐次消化を使用して猫の耳下腺伴うを単離するためのプロトコールについて説明した。1989では、・ハンおよび共同編集者は、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼおよび DNase5の混合物を使用してラット LGs からの伴う分離のためにこのプロトコルを調整した。1990年に、Cripps および同僚は、涙腺腺伴う6の非酵素的解離の方法を発表した。その後、1998において、Zoukhri および共同編集者は、LG および SMG 上で伴う+-イメージングを行うための酵素的解離プロトコルに戻った。過去10年間で、研究者は、外分泌腺から幹/前駆細胞の分離に焦点を当てています。プリングルおよび共同編集者は、マウス SMG 幹細胞8の単離のための2011のプロトコルを説明した。この方法は、培養において維持された幹細胞含有 salispheres の単離に基づいていた。著者らは、幹細胞関連マーカーを発現する増殖細胞は、これらの salispheres8から単離される可能性があると主張した。Shatos と共同編集者は、酵素消化と「遊離」細胞の収集を使用して、無傷成体ラット LGs から前駆細胞分離のためのプロトコルを発表しました9.後に、2015において、アッカーマンおよび共同編集者は、この手順を、複数継代10にわたってモノラル層培養として伝播することができた推定「ネズミ涙腺腺幹細胞」 (「mLGSCs」) を分離するように調整した。しかし、上記の手順のいずれも、細胞内亜型および単離された上皮細胞の個々の集団を区別するために認めた。2016で、グロモワおよび共同編集者は、FACS11を用いて成体ネズミ LGS から LG ステム/前駆細胞を単離するための手順を発表した。ただし、このプロトコルは MECs を分離するためのものではありません。
最近では、3週齢の SMA-GFP マウス12から sma + 細胞を分離することができることが示されています。しかし、現時点では、SMA + 細胞の異なる個体群を分離していません。ここでは、成人の LGs および SMGs から分化した MECs と周皮細胞を直接分離するための新しい手順を確立しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿は、LG と SMG からの MEC および周皮細胞分離のプロトコルを説明した。この手順は、SMA、MECs および周皮細胞の唯一の信頼できるバイオマーカーの遺伝的標識に基づいていました。
このプロトコルを開発する緊急性は、ネズミ LGs および SMGs からの MECs の分離を強調する文献のほぼ全ての欠如によって動機づけられた。遺伝子標識が以前に使用されていたが、SMA-GF…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、Kalajzic 博士は、 SMACreErt2 マウス株、マウスのテーリングとジェノタイピングのための Umazume たけし、図2のためのプロの写真を取得するためのマーク・シェリーに感謝します。また、科学的な英語編集のための科学エディターとマーク・シェリーのスクリプス評議会に感謝します。スクリプス研究所のフローサイトメトリーコアは、細胞選別と、FACS データ解析に関する複数の議論/アドバイスのための Dr. ロビン Willenbring に感謝しています。
この作品は、国立衛生研究所、国立眼科研究所助成金 5 R01 EY026202 と 1 R01 EY028983 によって支持されました H.P.M.
Materials
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 ml Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1000mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
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