בידוד של תאים מיואפיתל מתוך למבוגרים מורנה לקטמל בלוטות הלסת
Summary
בלוטת lacrimal (LG) יש שני סוגי תאים המבטא α-השריר החלקה אקטין (αSMA): מיואפיתל תאים (mecs) ו קרום הלב. MECs הם של מוצא העורי, נמצא ברקמות הבלוטות רבות, בעוד קרום הלב הם תאים שריר וסקולריים חלקה של מקור אנדועורי. פרוטוקול זה מבודד מנות וכלי קרום.
Abstract
בלוטת הדמעות (LG) היא בלוטת tubuloacexlayer האקסוקרינית אשר מפריש שכבה מימית של סרט דמעה. העץ האפיתל של LG מורכב של שכבתית, האפיתל ductal, ו מיואפיתל תאים (MECs). Mecs מבטא אלפא שריר חלק שרירים אקטין (αSMA) ויש להם פונקציה הקונאקטולה. הם נמצאים באברים בבלוטות מרובים והם בעלי המקור העורי. בנוסף, LG מכיל את התאים SMA שריר וסקולריים חלקה של מקור אנדועורי הנקרא קרום הלב: תאים הקונאקטולה לעטוף את פני השטח של צינורות כלי דם. פרוטוקול חדש מאפשר לנו לבודד הן MECs ו-קרום הלב של LGs מבוגרים מורלין ובלוטות הלסת התחתונה (SMGs). הפרוטוקול מבוסס על התיוג הגנטי של MECs ו קרום הלב באמצעות SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoחליל/חליל העכבר להתאמץ, ואחריו הכנה של LG תא יחיד ההשעיה עבור מיון התא המופעל פלואורסצנט (facs ). הפרוטוקול מאפשר הפרדה של שתי אוכלוסיות תאים אלה של מקורות שונים בהתבסס על הביטוי של המולקולה הדבקה תא האפיתל (EpCAM) על ידי MECs, ואילו קרום הלב לא לבטא EpCAM. ניתן להשתמש בתאים מבודדים לעיבוד תאים או לניתוח ביטוי גנטי.
Introduction
מיואפיתל תאים (MECs) נמצאים בבלוטות אקסוקרינית רבות כולל לקטמל, הרוק, הרדמי, זיעה, ערמונית, ופטמות. MECs הם סוג תא ייחודי המשלב האפיתל ואת שריר החלק פנוטיפים. Mecs express α-השריר החלקה אקטין (SMA) ויש להם פונקציה הקונאקטולה1,2. בנוסף ל-MECs, בלוטת lacrimal (LG) ואת בלוטת הלסת התחתונה (SMG) מכיל התאים SMA + כלי דם בשם קרום הלב, אשר הם תאים של מקור אנדועורי האופפים את פני השטח של צינורות וסקולרית3. למרות mecs ו קרום הלב לבטא סמנים רבים, SMA הוא הסמן היחיד שאינו מבוטא LG אחרים בתאי smg1,3.
בתוך 40 השנים האחרונות, מספר מעבדות שדווחו על הדיסוציאציה של רקמות בלוטת אקסוקרינית שונים, שבו הוחלו גישות לא אנזימטית ואנזימטית. באחד הדיווחים הראשונים שפורסמו בשנת 1980, פריץ ומחברים מתוארים בפרוטוקול לבודד את הפרוטריטיד החתול באמצעות עיכול רציף בתמיסה הקולגן/טריפסין פתרון4. ב 1989, Hann ומחברים הסתגלו פרוטוקול זה עבור בידוד acini מ-LGs חולדה באמצעות תערובת של הקולגן, hyaluronidase ו DNase5. ב 1990, Cripps ועמיתיו פרסמו את השיטה של דיסוציאציה לא אנזימטית של בלוטת לקטמל6. מאוחר יותר, בשנת 1998, Zoukhri ומחברים חוזרים לפרוטוקול דיסוציאציה אנזימטית עבור הבאים Ca2 +-הדמיה ב-LG ו smg מבודדים acini7. בתוך העשור האחרון, החוקרים הפכו את המיקוד שלהם על בידוד של תאים גזע/מחולל קדמון בלוטות אקסוקרינית. Pringle ומחברים תיאר פרוטוקול ב 2011 לבידוד של העכבר בתאי גזע SMG8. שיטה זו התבססה על בידוד של תאי גזע המכילים כדורי סאליריים, אשר שמרו בתרבות. המחברים טענו כי תאים מתרבים המבטא תא גזע הקשורים סמנים יכול להיות מבודד אלה כדורי הערבה8. שטואים ומחברי החוליה פרסמו את הפרוטוקול עבור בידוד תא מחולל קדמון מידי מבוגרים שנפגעו LGs חולדה באמצעות עיכול אנזימטי ואיסוף “משוחרר” תאים9. מאוחר יותר, בשנת 2015, אקרמן ומחברים הסתגלו הליך זה כדי לבודד שוערת “מורין לקטמל תאי גזע בלוטת” (“mLGSCs”) כי ניתן להפיץ כתרבות מונו שכבה על פני מספר מעברים10. עם זאת, אף אחד ההליכים לפני שהוזכר מותר להבדיל בין תת-סוגי הסלולר אוכלוסיות בודדות של תאים אפיתל מבודדים. בשנת 2016, מחלק מהגרובה והקוסופרים פרסמו הליך לבידוד של תאי גזע/מחולל בוגרים מ-LGs מבוגרים באמצעות FACS11. עם זאת, פרוטוקול זה לא נועד לבודד את MECs.
לאחרונה, הראינו כי אנו מסוגלים לבודד את התאים SMA + מתוך 3 שבוע בן SMA-GFP עכברים12. עם זאת, בשלב זה לא הפרידו אוכלוסיות שונות של SMA + תאים. כאן הקמנו הליך חדש עבור הבידוד הישיר של MECs הבדיל, קרום הלב מבוגרים LGs ו-SMGs.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב יד זה תיאר פרוטוקול של בידוד לקרום הלב של LG ו-SMG. הליך זה היה מבוסס על תיוג גנטי של SMA, הסמנים האמינים היחיד של MECs ו קרום הראש.
הדחיפות לפיתוח פרוטוקול זה היה מונע על ידי העדר כמעט מוחלט של ספרות המדגיש את הבידוד של MECs מ murine LGs ו-SMGs. למרות תיוג גנטי שימש בעבר, שימוש בעכברים SMA-GFP …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד ר Ivo Kalajzic עבור מתן לנו עם מאמץ העכבר SMACreErt2 , טאקשי umazume למעקב העכבר הגנואיות, מארק שלי לרכישת תמונות מקצועיות לאיור 2. כמו כן, אנו מודים למזכיר המועצה לעורכים מדעיים ומארק שלי לעריכה באנגלית מדעית. אנו אסירי תודה על מכון המחקר סקריפס זרימה Cy, ליבה לסיוע עם מיון תאים וכד Dr. רובין וילאנביא עבור דיונים מרובים/ייעוץ בניתוח נתונים של FACS.
עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי לעיניים מענקים 5 R01 EY026202 ו 1 R01 EY028983 ל H.P.M.
Materials
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 ml Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1000mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
- Makarenkova, H. P., Dartt, D. A. Myoepithelial Cells: Their Origin and Function in Lacrimal Gland Morphogenesis, Homeostasis, and Repair. Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 115-123 (2015).
- Haaksma, C. J., Schwartz, R. J., Tomasek, J. J. Myoepithelial cell contraction and milk ejection are impaired in mammary glands of mice lacking smooth muscle alpha-actin. Biology Of Reproduction. 85 (1), 13-21 (2011).
- Siedlecki, J., et al. Combined VEGF/PDGF inhibition using axitinib induces alphaSMA expression and a pro-fibrotic phenotype in human pericytes. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. , (2018).
- Fritz, M. E., LaVeau, P., Nahmias, A. J., Weigel, R. J., Lee, F. Primary cultures of feline acinar cells: dissociation, culturing, and viral infection. American Journal of Physiology. 239 (4), G288-G294 (1980).
- Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 145-158 (1989).
- Cripps, M. M., Bromberg, B. B., Bennett, D. J., Welch, M. H. Structure and function of non-enzymatically dissociated lacrimal gland acini. Current Eye Research. 10 (11), 1075-1080 (1991).
- Zoukhri, D., Hodges, R. R., Rawe, I. M., Dartt, D. A. Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1-adrenergic agonists is up-regulated in lacrimal and submandibular glands in a murine model of Sjogren’s syndrome. Clinical Immunology and Immunopathology. 89 (2), 134-140 (1998).
- Pringle, S., Nanduri, L. S., van der Zwaag, M., van Os, R., Coppes, R. P. Isolation of mouse salivary gland stem cells. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Ackermann, P., et al. Isolation and Investigation of Presumptive Murine Lacrimal Gland Stem Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Gromova, A., et al. Lacrimal Gland Repair Using Progenitor Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2017).
- Hawley, D., et al. Myoepithelial cell-driven acini contraction in response to oxytocin receptor stimulation is impaired in lacrimal glands of Sjogren’s syndrome animal models. Scientific Reports. 8 (1), 9919 (2018).
- Matic, I., et al. Quiescent Bone Lining Cells Are a Major Source of Osteoblasts During Adulthood. Stem Cells. 34 (12), 2930-2942 (2016).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Eckhard, U., Schonauer, E., Brandstetter, H. Structural basis for activity regulation and substrate preference of clostridial collagenases. G, H, and T. Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20184-20194 (2013).
- Breggia, A. C., Himmelfarb, J. Primary mouse renal tubular epithelial cells have variable injury tolerance to ischemic and chemical mediators of oxidative stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 1 (1), 33-38 (2008).
- Mueller, S. O., Clark, J. A., Myers, P. H., Korach, K. S. Mammary gland development in adult mice requires epithelial and stromal estrogen receptor alpha. Endocrinology. 143 (6), 2357-2365 (2002).
- Guthmiller, J. J., Zander, R. A., Butler, N. S. Measurement of the T Cell Response to Preerythrocytic Vaccination in Mice. Methods in Molecular Biology. 1325, 19-37 (2015).
- Seime, T., et al. Inducible cell labeling and lineage tracking during fracture repair. Development, Growth & Differentiation. 57 (1), 10-23 (2015).
- Hawley, D., et al. RNA-Seq and CyTOF immuno-profiling of regenerating lacrimal glands identifies a novel subset of cells expressing muscle-related proteins. PLoS One. 12 (6), e0179385 (2017).
- Tata, A., et al. Myoepithelial Cells of Submucosal Glands Can Function as Reserve Stem Cells to Regenerate Airways after Injury. Cell Stem Cell. 22 (5), 668-683 (2018).
- Song, E. C., et al. Genetic and scRNA-seq Analysis Reveals Distinct Cell Populations that Contribute to Salivary Gland Development and Maintenance. Scientific Reports. 8 (1), 14043 (2018).
- Knight, A. n. d. r. e. w. W., B, N. Distinguishing GFP from cellular autofluorescence. Biophotonics International. 8 (7), 7 (2001).
- Januszyk, M., et al. Evaluating the Effect of Cell Culture on Gene Expression in Primary Tissue Samples Using Microfluidic-Based Single Cell Transcriptional Analysis. Microarrays (Basel). 4 (4), 540-550 (2015).
