Isolierung von myepithelialen Zellen aus der Urmorine, Lacrimal und Submandibular Drüsen
Summary
Die Tränendrüse (LG) hat zwei Zelltypen, die α-glatte Muskelaktin (αSMA) ausdrücken: Myoepithelialzellen (MECs) und Pericytes. MECs sind ektodermaler Herkunft, der in vielen Drüsengeweben zu finden ist, während die Periicyten vaskuläre glatte Muskelzellen endodermalen Ursprungs sind. Dieses Protokoll isoliert MECs und Periicytes von murinen LGs.
Abstract
Die Tränendrüse (LG) ist eine exokrine Tubuloacinardrüse, die eine wässrige Schicht Tränenfilm abscheidet. Der LG-Epithelbaum besteht aus Akinar-, duktalen Epithel-und Myoepithelzellen (MECs). MECs drücken alpha glatte Muskelaktin (αSMA) aus und haben eine kontraktile Funktion. Sie sind in mehreren Drüsenorganen zu finden und sind ektodermalen Ursprungs. Darüber hinaus enthält das LG SMA + Gefäßglatte Muskelzellen endodermalen Ursprungs, die als Periicytes bezeichnet werden: Kontraktile Zellen, die die Oberfläche von Gefäßröhren umhüllen. Ein neues Protokoll ermöglicht es uns, sowohl MECs als auch Periicyte aus erwachsenen Murin-LGs und submandibulären Drüsen (SMGs) zu isolieren. Das Protokoll basiert auf der genetischen Kennzeichnung von MECs und Periicytes mit dem SMA CreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/. ). Das Protokoll erlaubt die Trennung dieser beiden Zellpopulationen unterschiedlicher Herkunft auf der Grundlage des Ausdrucks des epithelialen Zellhaftmoleküls (EpCAM) durch MECs, während Pericytes EpCAM nicht ausdrücken. Isolierte Zellen könnten für die Zellkultivierung oder Genexpressionsanalyse verwendet werden.
Introduction
Myoepitheliale Zellen (MECs) sind in vielen exokrinen Drüsen vorhanden, darunter Tränendrüsen, Speichel, Harderian, Schweiß, Prostata und Säugetiere. MECs sind ein einzigartiger Zelltyp, der einen Epithel-und einen glatten Muskelphenotyp kombiniert. MECs drücken α-smooth Muskelaktin (SMA) aus und haben eine kontraktile Funktion1,2. Die Tränendrüse (LG) und die submandibuläre Drüse (SMG) enthalten neben MECs auch SMA + Gefäßzellen, die Periicytes genannt werden, also Zellen endodermalen Ursprungs, die die Oberfläche von Gefäßrohren 3 umhüllen. Obwohl MECs und Periicytes viele Marker ausdrücken, ist SMA der einzige Marker, der nicht in anderen LG und SMG-Zellen1,3 ausgedrückt wird.
In den letzten 40 Jahren berichteten mehrere Labore von Untersuchungen zur Dissoziation verschiedener exokriner Drüsengewebe, in denen nicht-enzymatische und enzymatische Ansätze angewandt wurden. In einem der ersten Berichte, die 1980 veröffentlicht wurden, beschrieben Fritz und Co-Autoren ein Protokoll zur Isolierung von Katzenparotid acini mit sequenzieller Verdauung in einer Collagenase/Trypsin Lösung4. Im Jahr 1989 haben Hann und Coauthors dieses Protokoll für die Isolierung von Rat LGs mit einer Mischung aus Collagenase, Hyaluronidase und DNase5angepasst. 1990 veröffentlichten Cripps und Kollegen die Methode der nicht-enzymatischen Dissoziation der Tränendrüseacini 6. Später, im Jahr 1998, kehrten Zoukhri und Coautoren zu einem enzymatischen Dissoziationsprotokoll zurück, weil sie Ca2 +-Bildgebung auf LGundSMG isolierten acini 7 nachstellten. In den letzten zehn Jahren haben die Forscher ihren Fokus auf die Isolierung von Stamm/-Vorläuferzellen aus exokrinen Drüsen gerichtet. Pringle und Coauthors beschrieben 2011 ein Protokoll zur Isolierung von Mäuse-SMG-Stammzellen8. Diese Methode basierte auf der Isolierung von stammzellhaltigen Salisphären, die in der Kultur beibehalten wurden. Die Autoren behaupteten, dass sich vermehrende Zellen, die Stammzellmarker ausdrücken, von diesen Salisphären8isolieren könnten. Shatos und Coautoren veröffentlichten das Protokoll zur Vorläuferzellenisolierung von ungeschädigten erwachsenen Ratten-LGs mit enzymatischer Verdauung und dem Sammelnvon“befreiten” Zellen 9. Später, im Jahr 2015, passten Ackermann und Mitautoren dieses Verfahren an, um mutmaßliche “Murine-Tränendrein-Stammzellen” (“mLGSCs”) zu isolieren, die sich als Einschichtkultur über mehrerePassagen 10 verbreiten ließen. Allerdings ist keines der oben genannten Verfahren erlaubt, um zelluläre Subtypen und einzelne Populationen isolierter Epithelzellen zu unterscheiden. Im Jahr 2016 veröffentlichten Gromova und Coautoren ein Verfahren zur Isolierung von LG-Stem/Vorläuferzellen von erwachsenen Murin-LGs mit FACS11. Dieses Protokoll war jedoch nicht dazu gedacht, MECs zu isolieren.
Vor kurzem haben wir gezeigt, dass wir in der Lage sind, SMA +-Zellen von 3 Wochen alten SMA-GFP-Mäuse 12 zu isolieren. Zum jetzigen Zeitpunkt haben wir jedoch keine verschiedenen Populationen von SMA +-Zellen getrennt. Hier haben wir ein neues Verfahren zur direkten Isolierung von differenzierten MECs und Pericytes von erwachsenen LGs und SMGs eingeführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Manuskript beschrieb ein Protokoll von MEC und Perizyten-Isolierung von LG und SMG. Dieses Verfahren basierte auf der genetischen Kennzeichnung von SMA, dem einzigen zuverlässigen Biomarker von MECs und Periicytes.
Die Dringlichkeit, dieses Protokoll zu entwickeln, wurde durch das fast völlige Fehlen von Literatur motiviert, die die Isolierung von MECs von Murine LGs und SMGs hervorhob. Obwohl früher eine genetische Kennzeichnung verwendet wurde, die SMA-GFP-Mäuse zur Isolierung von…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Ivo Kalajzic für die Bereitstellung der SMA CreErt2-Maus-Stamm, Takeshi Umazume für das Mäuseschießen und Genotyping, Mark Shelley für den Erwerb von professionellen Bildern für Abbildung 2. Wir danken auch dem Scripps Council of Scientific Editors und Mark Shelley für die redaktionelle Bearbeitung von Scientific English. Wir danken dem Scripps Research Institute Flow Cytometry Core für die Unterstützung bei der Zellsortierung und Dr. Robin Willenbring für mehrere Diskussionen/Beratung zur FACS-Datenanalyse.
Diese Arbeit wurde unterstützt von den National Institutes of Health, National Eye Institute Grants 5 R01 EY026202 und 1 R01 EY028983 bis H.P.M.
Materials
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 ml Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1000mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
- Makarenkova, H. P., Dartt, D. A. Myoepithelial Cells: Their Origin and Function in Lacrimal Gland Morphogenesis, Homeostasis, and Repair. Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 115-123 (2015).
- Haaksma, C. J., Schwartz, R. J., Tomasek, J. J. Myoepithelial cell contraction and milk ejection are impaired in mammary glands of mice lacking smooth muscle alpha-actin. Biology Of Reproduction. 85 (1), 13-21 (2011).
- Siedlecki, J., et al. Combined VEGF/PDGF inhibition using axitinib induces alphaSMA expression and a pro-fibrotic phenotype in human pericytes. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. , (2018).
- Fritz, M. E., LaVeau, P., Nahmias, A. J., Weigel, R. J., Lee, F. Primary cultures of feline acinar cells: dissociation, culturing, and viral infection. American Journal of Physiology. 239 (4), G288-G294 (1980).
- Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 145-158 (1989).
- Cripps, M. M., Bromberg, B. B., Bennett, D. J., Welch, M. H. Structure and function of non-enzymatically dissociated lacrimal gland acini. Current Eye Research. 10 (11), 1075-1080 (1991).
- Zoukhri, D., Hodges, R. R., Rawe, I. M., Dartt, D. A. Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1-adrenergic agonists is up-regulated in lacrimal and submandibular glands in a murine model of Sjogren’s syndrome. Clinical Immunology and Immunopathology. 89 (2), 134-140 (1998).
- Pringle, S., Nanduri, L. S., van der Zwaag, M., van Os, R., Coppes, R. P. Isolation of mouse salivary gland stem cells. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Ackermann, P., et al. Isolation and Investigation of Presumptive Murine Lacrimal Gland Stem Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Gromova, A., et al. Lacrimal Gland Repair Using Progenitor Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2017).
- Hawley, D., et al. Myoepithelial cell-driven acini contraction in response to oxytocin receptor stimulation is impaired in lacrimal glands of Sjogren’s syndrome animal models. Scientific Reports. 8 (1), 9919 (2018).
- Matic, I., et al. Quiescent Bone Lining Cells Are a Major Source of Osteoblasts During Adulthood. Stem Cells. 34 (12), 2930-2942 (2016).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Eckhard, U., Schonauer, E., Brandstetter, H. Structural basis for activity regulation and substrate preference of clostridial collagenases. G, H, and T. Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20184-20194 (2013).
- Breggia, A. C., Himmelfarb, J. Primary mouse renal tubular epithelial cells have variable injury tolerance to ischemic and chemical mediators of oxidative stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 1 (1), 33-38 (2008).
- Mueller, S. O., Clark, J. A., Myers, P. H., Korach, K. S. Mammary gland development in adult mice requires epithelial and stromal estrogen receptor alpha. Endocrinology. 143 (6), 2357-2365 (2002).
- Guthmiller, J. J., Zander, R. A., Butler, N. S. Measurement of the T Cell Response to Preerythrocytic Vaccination in Mice. Methods in Molecular Biology. 1325, 19-37 (2015).
- Seime, T., et al. Inducible cell labeling and lineage tracking during fracture repair. Development, Growth & Differentiation. 57 (1), 10-23 (2015).
- Hawley, D., et al. RNA-Seq and CyTOF immuno-profiling of regenerating lacrimal glands identifies a novel subset of cells expressing muscle-related proteins. PLoS One. 12 (6), e0179385 (2017).
- Tata, A., et al. Myoepithelial Cells of Submucosal Glands Can Function as Reserve Stem Cells to Regenerate Airways after Injury. Cell Stem Cell. 22 (5), 668-683 (2018).
- Song, E. C., et al. Genetic and scRNA-seq Analysis Reveals Distinct Cell Populations that Contribute to Salivary Gland Development and Maintenance. Scientific Reports. 8 (1), 14043 (2018).
- Knight, A. n. d. r. e. w. W., B, N. Distinguishing GFP from cellular autofluorescence. Biophotonics International. 8 (7), 7 (2001).
- Januszyk, M., et al. Evaluating the Effect of Cell Culture on Gene Expression in Primary Tissue Samples Using Microfluidic-Based Single Cell Transcriptional Analysis. Microarrays (Basel). 4 (4), 540-550 (2015).
