Een in vitro protocol voor het evalueren van MicroRNA-niveaus, functies en geassocieerde doel genen in tumor cellen
Summary
Dit protocol maakt gebruik van een sonde-gebaseerde real-time polymerase kettingreactie (PCR), een sulforhodamine B (SRB) Assay, 3 ‘ onvertaalde gebieden (3 ‘ UTR) klonen, en een plaats assay om de doel genen van een Mirna van belang te controleren en om de functies van miRNAs te begrijpen.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) zijn kleine regelgevende Rna’s die worden erkend voor het moduleren van talrijke intracellulaire signalering trajecten in verschillende ziekten, waaronder kankers. Deze kleine regelgevende Rna’s communiceren voornamelijk met de 3 ‘ onvertaalde gebieden (3 ‘ UTR) van hun doel Messenger RNAs (Mrna’s), wat uiteindelijk resulteert in de remming van decoderings processen van Mrna’s en de augmentatie van doel mRNA-degraderingen. Op basis van de uitdrukkings niveaus en intracellulaire functies zijn miRNAs in staat om te dienen als regelgevende factoren van oncogene en tumor suppressieve Mrna’s. Identificatie van bonafide doel genen van een miRNA tussen honderden of zelfs duizenden computationeel voorspelde doelen is een cruciale stap om de rollen en elementaire moleculaire mechanismen van een miRNA van belang te onderscheiden. Verschillende miRNA target Voorspellings Programma’s zijn beschikbaar om te zoeken naar mogelijke interacties van miRNA-mRNA. De meest uitdagende vraag is echter hoe je directe doel genen van een miRNA van belang moet valideren. Dit protocol beschrijft een reproduceerbare strategie van belangrijke methoden om miRNA-doelen te identificeren die verband houden met de functie van een miRNA. Dit protocol presenteert een praktische gids over stapsgewijze procedures om miRNA-niveaus,-functies en gerelateerde doel-Mrna’s te achterhalen met behulp van de sonde-gebaseerde real-time polymerase kettingreactie (PCR), sulforhodamine B (SRB)-assay na een miRNA-nabootsen transfectie , dosis-responscurve generatie, en plaats assay samen met het klonen van 3 ‘ UTR van een gen, die nodig is voor een goed begrip van de rollen van individuele miRNAs.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) zijn de kleine regelgevende Rna’s die voornamelijk het proces van vertaling en afbraak van boodschapper Rna’s (Mrna’s) moduleren door te reageren op de 3 ‘ onvertaalde gebieden (3 ‘ UTR) in bonafide doel genen1. De expressie van miRNAs kan worden gereguleerd door transcriptionele en post-transcriptionele mechanismen. De onevenwichtigheid van dergelijke regelgevende mechanismen brengt ongecontroleerde en onderscheidende miRNAs-uitdrukkings niveaus in tal van ziekten, waaronder kanker2. Eén enkele miRNA kan meerdere interacties met diverse Mrna’s hebben. Dienovereenkomstig kan een individuele mRNA worden bestuurd door verschillende Mirna’s. Daarom, intracellulaire signalering netwerken worden ingewikkeld beïnvloed door duidelijk uitgedrukt miRNAs waardoor fysiologische aandoeningen en ziekten kunnen worden geïnitieerd en verslechterd2,3,4, 5 , 6. Hoewel de veranderde expressie van miRNAs is waargenomen in verschillende soorten kankers, zijn de moleculaire mechanismen die de manieren van kankercellen in combinatie met miRNAs moduleren nog steeds grotendeels onbekend.
Accumulerend bewijsmateriaal toont aan dat de oncogene of tumor suppressieve rollen van miRNAs afhangen van de soorten kanker. Door bijvoorbeeld te richten op Forkhead Box O3 (FOXO3) bevordert miR-155 de celproliferatie, metastase en chemoresistance van colorectale kanker7,8. Daarentegen wordt de beperking van glioom celinvasie geïnduceerd door miR-107 via de regulatie van neurogene Locus notch homo Protein 2 (NOTCH2) expressie9. De beoordeling van miRNA-target interacties in verband met miRNA-functies is een onmisbaar onderdeel om beter te begrijpen hoe miRNAs verschillende biologische processen regelt in zowel gezonde als zieke Staten10. Bovendien kan de ontdekking van het bonafide doelwit (en) van miRNAs verder een nauwkeurig afgestemde strategie bieden voor een op miRNA gebaseerde therapie met verschillende anti-kankergeneesmiddelen. De belangrijkste uitdaging op het gebied van miRNAs is echter de identificatie van directe targets van miRNAs. Hier worden gedetailleerde methoden gepresenteerd als reproduceerbare experimentele benaderingen voor de doelbepaling van het miRNA-doelwit. Succesvol experimenteel ontwerp voor de doel identificatie miRNA omvat verschillende stappen en overwegingen (Figuur 1). Vergelijking van volwassen miRNA-niveaus in tumorcellen en normale cellen kan een van de gebruikelijke procedures zijn om een miRNA van belang te selecteren (Figuur 1a). De functionele studie van een geselecteerde miRNA om de effecten van een miRNA op celproliferatie op te sporen is belangrijk om de lijst van de beste potentiële kandidaatdoelen van een miRNA van belang te verfijnen (Figuur 1b). Op basis van de experimenteel gevalideerde functies van miRNAs is een systematische beoordeling van literatuur en database in bedrijf met een miRNA target Voorspellings programma vereist om de meest relevante informatie over genfuncties te doorzoeken (figuur 1c). De identificatie van reële doel genen van een Mirna van belang kan worden bereikt door het uitvoeren van experimenten zoals de plaats-assay samen met het klonen van 3 ‘ UTR van een gen, real-time PCR en Western blotting (figuur 1d). Het doel van het huidige protocol is om uitgebreide methoden te bieden voor belangrijke experimenten, de op sonde gebaseerde real-time polymerase kettingreactie (PCR), sulforhodamine B (SRB) assay na een nabootsen van de miRNA-transactie, het genereren van dosis-responscurve, en plaats assay samen met het klonen van 3 ‘ UTR van een gen. Het huidige protocol kan nuttig zijn voor een beter begrip van de functies van individuele miRNAs en de implicatie van een miRNA bij kankertherapie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Strategieën voor de bepaling van bonafide miRNA-doelen met de functies van een miRNA van belang zijn onmisbaar voor het begrijpen van meerdere rollen van miRNAs. Identificatie van de doel genen van miRNA kan een leid waarde zijn voor het interpreteren van de cel signalering van gebeurtenissen die door miRNAs in een cel worden gemoduleerd. Een ontveiling van functioneel belangrijke doel genen van miRNAs kan de fundamentele kennis bieden om een op miRNA gebaseerde therapie in kanker te ontwikkelen.
<p class="jove_cont…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door het basisprogramma voor wetenschappelijk onderzoek via de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van onderwijs (2017R1D1A3B03035662); en Hallym University Research Fund, 2017 (HRF-201703-003).
Materials
| 15 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50050 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | |
| 6X DNA loading dye | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8-cap strip | Applied Biosystems | N8010535 | For cDNA synthesis |
| 8-tube strip | Applied Biosystems | N8010580 | For cDNA synthesis |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Acetic acid | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
| Ampicillin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 tube strips | Agilent Technologies | 401493 | For real time PCR |
| AriaMx real-time PCR system | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplification, detection, and data analysis |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 units/mL |
| CAPAN-1 cells | ATCC | HTB-79 | |
| Cell culture hood | Labtech | Model: LCB-1203B-A2 | |
| Counting chambers with V-slash | Paul Marienfeld | 650010 | Cells counter |
| CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | 10X concentration |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| DNA gel extraction kit | Bionics | DN30200 | 200 prep |
| DNA ladder | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb ladder |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 units |
| Dual-luciferase reporter assay system | Promega | E1910 | 100 assays |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT competent cells | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | Competent cells |
| HPNE cells | ATCC | CRL-4023 | |
| LB agar broth | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| Luminometer | Promega | Model: E5311 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Microplate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (electrophoresis system) | TaKaRa | Model: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 units/mL |
| Oligo explorer program | GeneLink | For primer design | |
| Optical tube strip caps (8X Strip) | Agilent Technologies | 401425 | For real time PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 cells | ATCC | CRL-1469 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Plasmid DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA polymerase | TaKaRa | R050A | 250 units |
| Shaker | TECAN | Shaking platform | |
| Shaking incubator | Labtech | Model: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 software | Systat Software Inc | For dose-response curve generation | |
| Sulforhodamine B powder | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Binding fluorescent dye for dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 reactions, no AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | 1000 reactions |
| Thermo CO2 incubator (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 °C and 5% CO2 incubation | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Trizma base | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Ultrapure water | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | For amplification of DNA (or cDNA) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 units/mL |
References
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Park, J. K., et al. MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy. Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).
- Henry, J. C., et al. miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).
- Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
- Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).
- Khoshinani, H. M., et al. Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line. Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).
- Gao, Y., et al. MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3. Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).
- Catanzaro, G., et al. Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs). International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).
- Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. The hunting of targets: challenge in miRNA research. Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).
- Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells. Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).
- Xia, X., et al. Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN. American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).
- Lee, K. H., et al. Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer. Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).
- van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes. 8, 47 (2015).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS One. 5 (4), e10202 (2010).
- Wu, L., Belasco, J. G. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).
- Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay. Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).
- Ma, Z., et al. Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation. Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).
- Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).
- Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches. Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).
- Lee, E. J., et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).
- Nuovo, G. J., et al. A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets. Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).
- Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44 (1), 31-38 (2008).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).
- Orellana, E. A., Kasinski, A. L. Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation. Bio Protocol. 6 (21), (2016).
- Lawrie, C. H. MicroRNAs in hematological malignancies. Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. MicroRNAs and anticancer drugs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).
- Moeng, S., et al. MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide. Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).
- Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).
- Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing. Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).
