Summary

Tümör hücrelerinde MicroRNA seviyeleri, fonksiyonları ve Ilişkili hedef genler değerlendirmek için bir In vitro protokol

Published: May 21, 2019
doi:

Summary

Bu protokol bir prob tabanlı gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), bir sülforhodamin içinde B (SRB) tahlil, 3 ‘ tercüme edilmemiş bölgeler (3 ‘ UTR) klonlama ve bir Lusiferaz tahlil ilgi bir Mirna hedef genler doğrulamak ve mirnas işlevlerini anlamak için kullanır.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs), kanserler de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda çok sayıda hücre içi sinyalizasyon yollarını modülasyon olarak tanınan küçük düzenleyici RNAs ‘lardır. Bu küçük düzenleyici RNAs ağırlıklı olarak 3 ‘ tercüme edilmemiş bölgeler (3 ‘ UTR) hedef haberci RNAs (mRNAs) ile etkileşim sonuçta mRNAs çözme süreçlerinin inhibisyonu ve hedef mRNA degradations büyütme sonuçlanan. MiRNAs, ifade düzeylerine ve hücre içi işlevlere bağlı olarak Onkojenik ve tümör bastırıcı MRI ‘nin düzenleyici faktörler olarak hizmet verebilir. Yüzlerce ve hatta binlerce hesaplamalarıyla öngörülen hedefler arasında bir miRNA ‘nın iyi niyetli hedef genlerinin tanımlanması, bir miRNA ‘nın rol ve temel moleküler mekanizmalarını ayırt etmek için önemli bir adımdır. Çeşitli miRNA hedef tahmin programları olası miRNA-mRNA etkileşimlerini aramak için kullanılabilir. Ancak, en zorlu soru nasıl bir miRNA ilgi doğrudan hedef genleri doğrulamak için. Bu protokol bir miRNA işlevi ile ilgili miRNA hedeflerini tanımlamak nasıl anahtar yöntemleri tekrarlanabilir bir strateji açıklanır. Bu protokol, Mirna seviyeleri, fonksiyonları ve ilgili hedef mrnas ‘ı Probe tabanlı gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), sülforhodamin içinde B (SRB) tahlil bir Mirna taklit transfeksiyon aşağıdaki kullanarak ortaya çıkarmak için adım adım prosedürler üzerinde pratik bir kılavuz sunar , doz-yanıt eğrisi oluşturma, ve Lusiferaz tahlil birlikte klonlama ile 3 ‘ UTR bir gen, hangi bireysel mirnas rollerini doğru anlayış için gerekli olan.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs), özellikle haberci RNAs ‘ın (mRNAs) tercüme ve bozulma sürecini, gerçek hedef genler1‘ de 3 ‘ tercüme edilmemiş bölgeye (3 ‘ UTR) tepki vererek modüle eden küçük düzenleyici RK ‘lerdir. Mirnas ‘ın ifadesi transkripsiyon ve post-transkripsiyonel mekanizmalar tarafından düzenlenebilir. Bu tür Düzenleyici mekanizmaların dengesizliği, kanserler de dahil olmak üzere sayısız hastalıklarda kontrolsüz ve ayırt edici miRNAs ifade düzeylerini getiriyor2. Tek bir miRNA çeşitli MRI ‘lar ile birden fazla etkileşime sahip olabilir. Buna karşılık, bireysel mRNA çeşitli miRNAs tarafından kontrol edilebilir. Bu nedenle, hücre içi sinyalizasyon ağları, fizyolojik bozuklukların ve hastalıkların başlatılacağı ve bozulacağı2,3,4, 5 , 6. mirnas ‘ın değiştirilmiş ifadesi çeşitli kanserlerde gözlenen olsa da, mirnas ile birlikte kanser hücrelerinin davranışlarını modüle eden moleküler mekanizmalar hala büyük ölçüde bilinmiyor.

Biriken kanıtlar, miRNAs ‘ın Onkojenik veya tümör bastırıcı rollerini kanserlerin türlerine bağlı olduğunu gösteriyor. Örneğin, Forkhead kutusu O3 (FOXO3) hedefleyerek, Mir-155, hücre proliferasyonu, metasoz ve kolorektal kanser kemoterapi yükseltir7,8. Buna karşılık, glioma hücre invazyonu kısıtlama nörojenik Locus çentik homolog protein 2 (NOTCH2) ifade9düzenlenmesi yoluyla miR-107 tarafından indüklenir. Mirna işlevleriyle bağlantılı mirla-Target etkileşimlerinin değerlendirilmesi, miRNAs ‘ın hem sağlıklı hem de hastalıklı Devletler10‘ da çeşitli biyolojik süreçleri nasıl düzenlemesini daha iyi anlamak için vazgeçilmez bir parçasıdır. Buna ek olarak, miRNAs ‘ın iyi niyetli hedef (ler) keşfi, çeşitli anti-kanser ilaçları ile miRNA tabanlı bir terapi için ince ayarlı bir strateji sağlayabilir. Ancak, miRNAs alanındaki ana meydan okuma, miRNAs ‘ın doğrudan hedeflerini tanımlamadır. Burada, Mirna hedef gen belirlenmesi için tekrarlanabilir deneysel yaklaşımlar olarak ayrıntılı yöntemler sunulmaktadır. MiRNA hedef tanımlaması için başarılı deneysel tasarım çeşitli adımlar ve hususlar içerir (Şekil 1). Tümör hücrelerinde ve normal hücrelerde olgun miRNA düzeylerinin karşılaştırılması, ilgi bir miRNA seçmek için ortak prosedürlerden biri olabilir (Şekil 1a). Bir Mirna ‘nın hücre proliferasyonu üzerindeki etkilerini algılamak için seçilen miRNA ‘nın fonksiyonel çalışması, bir miRNA ‘nın en iyi potansiyel aday hedefleri listesini daraltmak için önemlidir (Şekil 1B). MiRNAs ‘ın deneysel olarak doğrulanmış işlevlerine dayanarak, gen işlevleriyle ilgili en alakalı bilgileri aramak için miRNA hedef tahmin programı ile birlikte literatür ve veritabanı alanında sistematik bir inceleme gereklidir (Şekil 1C). Bir Mirna ‘nın gerçek hedef genlerinin tanımlanması, Lusiferaz tahlil gibi bir genin 3 ‘ UTR, gerçek zamanlı PCR ve Batı blomlama (Şekil 1D) Klonlamayla birlikte deneyler uygulayarak elde edilebilir. Geçerli protokolün amacı, önemli deneylerin kapsamlı yöntemlerini, prob bazlı gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), miRNA mimik transfeksiyonunu takiben sülforhodamin B (SRB) tahlil, doz-yanıt eğrisi üretimi ve bir gen 3 ‘ UTR klonlama ile birlikte Lusiferaz tahlil. Geçerli protokol bireysel miRNAs fonksiyonları daha iyi bir anlayış ve kanser tedavisinde bir miRNA dolaylı için yararlı olabilir.

Protocol

1. olgun MicroRNA (miRNA) Ifade Analizi Olgun miRNA tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezini 254 ng toplam RNA ve 4,5 μL deoksirribonuclease ı (DNase ı) karışımları ekleyin ve sonra 18 μL (Şekil 2a) yapmak için PCR Strip-tüpler içine ultra saf su ekleyin. Toplam reaksiyon sayısına dayalı olarak yeterli sayıda DNase ı karışımı kullanarak çeşitli hücre hatlarından arındırılmış her toplam RNA örneği için reaksiyonu hazırlayın.<b…

Representative Results

MiRNA ‘nın sınıflandırılmasının, bir hastalığın gelişimi ve ilerlemesinde miRNAs ‘ın beklenen rollerini temel alan verilerin yorumlanması için başarılı ve doğru bir şekilde onaylaması önemlidir. MiRNA-107 ve miRNA-301 seviyeleri, prob bazlı niceliksel PCR kullanılarak üç pankreas hücresi çizginde ölçülmüştür. Hem belirli bir miRNA ‘nın hem de aynı reaksiyonda bir referans geni olan cDNAs sentezini veri yeniden üretilebilirliğini artırabilir. Panc-1 ve capan-1 insan pankreatik duktal …

Discussion

MiRNA ‘nın bir miRNA ‘nın fonksiyonları ile en uygun şekilde belirlenmesine yönelik stratejiler, Mırnas ‘ın birden çok rolünün anlaşılması için vazgeçilmez bir unsurdır. MiRNA hedef genlerinin tanımlanması, bir hücrede miRNAs tarafından modüle edilen hücre sinyalizasyon olaylarını yorumlamak için bir kılavuz olabilir. MiRNAs ‘ın işlevsel olarak önemli hedef genlerinin bir açıklanması, kanserde miRNA tabanlı bir tedavi geliştirmek için temel bilgi sağlayabilir.

<p class="jove_conten…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışmada, Eğitim Bakanlığı (2017R1D1A3B03035662) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) aracılığıyla temel bilim araştırma programı tarafından destekleniyordu; ve Hallym Üniversitesi Araştırma Fonu, 2017 (HRF-201703-003).

Materials

15 mL conical tube SPL Life Sciences 50015
24-well plate Thermo Scientific 142475
50 mL conical tube SPL Life Sciences 50050
6-well plate Falcon 353046
6X DNA loading dye Real Biotech Corporation RD006 1 mL
8-cap strip Applied Biosystems N8010535 For cDNA synthesis
8-tube strip Applied Biosystems N8010580 For cDNA synthesis
96-well plate Falcon 353072
Acetic acid Sigma A6283-1L 1 L
Agarose A Bio Basic D0012 500 g
Alkaline phosphatase New England Biolabs M0290S 10,000 U/mL
Ampicillin Bio basic Canada Inc AB0028 25 g
AriaMx 96 tube strips Agilent Technologies 401493 For real time PCR
AriaMx real-time PCR system Agilent Technologies G8830A qPCR amplification, detection, and data analysis
AsiSI New England Biolabs R0630 10,000 units/mL
CAPAN-1 cells ATCC HTB-79
Cell culture hood Labtech Model: LCB-1203B-A2
Counting chambers with V-slash Paul Marienfeld 650010 Cells counter
CutSmart buffer New England Biolabs B7204S 10X concentration
DMEM Gibco 11965-092 500 mL
DNA gel extraction kit Bionics DN30200 200 prep
DNA ladder NIPPON Genetics EUROPE MWD1 1 Kb ladder
DNase I Invitrogen 18068015 100 units
Dual-luciferase reporter assay system Promega E1910 100 assays
Fetal bovine serum Gibco 26140-079 500 mL
HIT competent cells Real Biotech Corporation(RBC) RH617 Competent cells
HPNE cells ATCC CRL-4023
LB agar broth Bio Basic SD7003 250 g
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 0.75 mL
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-075 0.75 mL
Luminometer Promega Model: E5311
Microcentrifuge tube Eppendorf 22431021
Microplate reader TECAN Infinite F50
miRNA control mimic Ambion 4464058 5 nmole
miRNA-107 mimic Ambion 4464066 5 nmole
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 50 prep
Mupid-2plus (electrophoresis system) TaKaRa Model: AD110
NotI New England Biolabs R3189 20,000 units/mL
Oligo explorer program GeneLink For primer design
Optical tube strip caps (8X Strip) Agilent Technologies 401425 For real time PCR
Opti-MEM Gibco 31985-070 500 Ml
PANC-1 cells ATCC CRL-1469
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122 100 mL
Phosphate buffer saline Gibco 14040117 1000 mL
Plasmid DNA miniprep S& V kit Bionics DN10200 200 prep
PrimeSTAR GXL DNA polymerase TaKaRa R050A 250 units
Shaker TECAN Shaking platform
Shaking incubator Labtech Model: LSI-3016A
Sigmaplot 14 software Systat Software Inc For dose-response curve generation
Sulforhodamine B powder Sigma S1402-5G 5 g
SYBR green master mix Smobio TQ12001805401-3 Binding fluorescent dye for dsDNA
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A 25,000 U
TaqMan master mix Applied Biosystems 4324018 200 reactions, no AmpErase UNG
TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) Applied Biosystems 4427975 Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)
TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) Applied Biosystems 4427975 Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)
TaqMan miR RT kit Applied Biosystems 4366597 1000 reactions
Thermo CO2 incubator (BB15) ThermoFisher Scientific 37 °C and 5% CO2 incubation
Trichloroacetic acid Sigma 91228-100G 100 g
Trizma base Sigma T4661-100G 100 g
Ultrapure water Invitrogen 10977-015 500 mL
Veriti 96 well thermal cycler Applied Biosystems For amplification of DNA (or cDNA)
XhoI New England Biolabs R0146 20,000 units/mL

References

  1. He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
  2. Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
  3. Park, J. K., et al. MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy. Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).
  4. Henry, J. C., et al. miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).
  5. Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
  6. Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).
  7. Khoshinani, H. M., et al. Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line. Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).
  8. Gao, Y., et al. MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3. Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).
  9. Catanzaro, G., et al. Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs). International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).
  10. Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. The hunting of targets: challenge in miRNA research. Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).
  11. Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).
  12. Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
  13. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  14. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  15. Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells. Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).
  16. Xia, X., et al. Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN. American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).
  17. Lee, K. H., et al. Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer. Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).
  18. van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes. 8, 47 (2015).
  19. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS One. 5 (4), e10202 (2010).
  20. Wu, L., Belasco, J. G. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).
  21. Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay. Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).
  22. Ma, Z., et al. Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation. Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).
  23. Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).
  24. Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches. Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).
  25. Lee, E. J., et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).
  26. Nuovo, G. J., et al. A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets. Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).
  27. Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44 (1), 31-38 (2008).
  28. Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).
  29. Orellana, E. A., Kasinski, A. L. Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation. Bio Protocol. 6 (21), (2016).
  30. Lawrie, C. H. MicroRNAs in hematological malignancies. Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).
  31. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).
  32. Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. MicroRNAs and anticancer drugs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).
  33. Moeng, S., et al. MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide. Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).
  34. Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).
  35. Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing. Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).

Play Video

Cite This Article
Seo, H. A., Hwang, C. Y., Moeng, S., Park, J. K. An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells. J. Vis. Exp. (147), e59628, doi:10.3791/59628 (2019).

View Video