Un protocolo in vitro para evaluar los niveles, funciones y genes objetivo asociados de MicroRNA en células tumorales
Summary
Este protocolo utiliza una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada en sondas en tiempo real, un ensayo de sulforhodamine B (SRB), 3′ regiones no traducidas (3′ UTR) clonación, y un ensayo de luciferasa para verificar los genes diana de un miRNA de interés y para entender las funciones de los miRNAs.
Abstract
Los MicroRNAs (miRNAs) son pequeños ARN reguladores que se reconocen para modular numerosas vías de señalización intracelular en varias enfermedades, incluidos los cánceres. Estos pequeños ARN reguladores interactúan principalmente con las 3′ regiones no traducidas (3′ UTR) de sus ARN mensajeros objetivo (RNN) lo que en última instancia resulta en la inhibición de los procesos de decodificación de ARNM y el aumento de las degradaciones de ARNm objetivo. Basados en los niveles de expresión y las funciones intracelulares, los miRNAs son capaces de servir como factores reguladores de los ARNM oncogénicos y supresores tumorales. La identificación de genes diana de buena fe de un miRNA entre cientos o incluso miles de objetivos predicados computacionalmente es un paso crucial para discernir las funciones y los mecanismos moleculares básicos de un miRNA de interés. Varios programas de predicción de objetivos de miRNA están disponibles para buscar posibles interacciones miRNA-mRNA. Sin embargo, la pregunta más difícil es cómo validar los genes diana directos de un miRNA de interés. Este protocolo describe una estrategia reproducible de métodos clave sobre cómo identificar objetivos de miRNA relacionados con la función de un miRNA. Este protocolo presenta una guía práctica sobre los procedimientos paso a paso para descubrir los niveles de miRNA, funciones y ARNM objetivo relacionados utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada en la sonda, el ensayo de sulforhodamine B (SRB) después de una imitación de miRNA en la transfección , la generación de curvas de dosis-respuesta y el ensayo de luciferasa junto con la clonación de 3′ UTR de un gen, que es necesario para una comprensión adecuada de las funciones de los miRNAs individuales.
Introduction
Los MicroARN (miRNAs) son los pequeños ARN reguladores que modulan principalmente el proceso de traducción y degradación de los ARN mensajeros (ARN) reaccionando a las 3′ regiones no traducidas (3′ UTR) en genes diana de buena fe1. La expresión de los miRNAs puede ser regulada por mecanismos transcripcionales y post-transcripcionales. El desequilibrio de estos mecanismos reglamentarios aporta niveles de expresión de miRNAs no controlados y distintivos en numerosas enfermedades, incluidos los cánceres2. Un solo miRNA puede tener múltiples interacciones con diversos ARNm. En consecuencia, un ARNm individual puede ser controlado por varios miRNAs. Por lo tanto, las redes de señalización intracelular están intrincadamente influenciadas por miRNA distintivamente expresadas por las cuales se pueden iniciar y deteriorar trastornos fisiológicos y enfermedades2,3,4, 5 , 6. Aunque la expresión alterada de los miRNAs se ha observado en varios tipos de cánceres, los mecanismos moleculares que modulan las formas de las células cancerosas en conjunto con los miRNAs son todavía en gran medida desconocidos.
La acumulación de evidencia ha estado demostrando que los roles oncogénicos o supresores de tumores de los miRNAs dependen de los tipos de cáncer. Por ejemplo, al apuntar a la caja de cabezal de horquilla o3 (FOXO3), miR-155 promueve la proliferación celular, metástasis y quimiorresistencia del cáncer colorrectal7,8. Por el contrario, la restricción de la invasión de células de glioma es inducida por miR-107 a través de la regulación de la locus de locus homolog proteína 2 (NOTCH2) expresión9. La evaluación de las interacciones miRNA-objetivo en relación con las funciones de miRNA es una parte indispensable para entender mejor cómo los miRNAs regulan varios procesos biológicos tanto en estados sanos como enfermos10. Además, el descubrimiento de objetivos de buena fe de los miRNAs puede proporcionar aún más una estrategia ajustada para una terapia basada en miRNA con varios medicamentos contra el cáncer. Sin embargo, el principal desafío en el campo de los miRNAs es la identificación de objetivos directos de los miRNAs. Aquí, los métodos detallados se presentan como enfoques experimentales reproducibles para la determinación del gen objetivo del miRNA. El diseño experimental exitoso para la identificación del objetivo miRNA implica varios pasos y consideraciones (Figura1). La comparación de los niveles de miRNA maduros en células tumorales y células normales puede ser uno de los procedimientos comunes para seleccionar un miRNA de interés (Figura1A). El estudio funcional de un miRNA seleccionado para detectar los efectos de un miRNA en la proliferación celular es importante para reducir la lista de los mejores objetivos candidatos potenciales de un miRNA de interés (Figura1B). Sobre la base de las funciones validadas experimentalmente de los miRNAs, se requiere una revisión sistemática de la literatura y la base de datos en compañía con un programa de predicción de objetivos de miRNA para buscar la información más relevante sobre las funciones genéticas (Figura1C). La identificación de genes diana reales de un miRNA de interés se puede lograr mediante la implementación de experimentos como el ensayo de luciferasa junto con la clonación de 3′ UTR de un gen, PCR en tiempo real, y la hincha occidental (Figura1D). El objetivo del protocolo actual es proporcionar métodos integrales de experimentos clave, la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real basada en sondas (PCR), el ensayo de sulforhodamine B (SRB) después de una transfección mimimetial, la generación de curvas de dosis-respuesta y un ensayo de imitación de miRNA, la generación de curvas de dosis-respuesta y ensayo de luciferasa junto con la clonación de 3′ UTR de un gen. El protocolo actual puede ser útil para una mejor comprensión de las funciones de los miRNAs individuales y la implicación de un miRNA en la terapia contra el cáncer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las estrategias para la determinación de objetivos de miRNA de buena fe con las funciones de un miRNA de interés son indispensables para la comprensión de múltiples funciones de los miRNAs. La identificación de genes diana de miRNA puede ser una guía para interpretar los eventos de señalización celular modulados por los miRNAs en una célula. Una revelación de genes diana funcionalmente importantes de los miRNAs puede proporcionar el conocimiento fundamental para desarrollar una terapia basada en miRNA en el cá…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el Programa de Investigación de Ciencia Sacial A través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de Educación (2017R1D1A3B03035662); y el Fondo de Investigación de la Universidad de Hallym, 2017 (HRF-201703-003).
Materials
| 15 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50050 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | |
| 6X DNA loading dye | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8-cap strip | Applied Biosystems | N8010535 | For cDNA synthesis |
| 8-tube strip | Applied Biosystems | N8010580 | For cDNA synthesis |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Acetic acid | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
| Ampicillin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 tube strips | Agilent Technologies | 401493 | For real time PCR |
| AriaMx real-time PCR system | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplification, detection, and data analysis |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 units/mL |
| CAPAN-1 cells | ATCC | HTB-79 | |
| Cell culture hood | Labtech | Model: LCB-1203B-A2 | |
| Counting chambers with V-slash | Paul Marienfeld | 650010 | Cells counter |
| CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | 10X concentration |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| DNA gel extraction kit | Bionics | DN30200 | 200 prep |
| DNA ladder | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb ladder |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 units |
| Dual-luciferase reporter assay system | Promega | E1910 | 100 assays |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT competent cells | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | Competent cells |
| HPNE cells | ATCC | CRL-4023 | |
| LB agar broth | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| Luminometer | Promega | Model: E5311 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Microplate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (electrophoresis system) | TaKaRa | Model: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 units/mL |
| Oligo explorer program | GeneLink | For primer design | |
| Optical tube strip caps (8X Strip) | Agilent Technologies | 401425 | For real time PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 cells | ATCC | CRL-1469 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Plasmid DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA polymerase | TaKaRa | R050A | 250 units |
| Shaker | TECAN | Shaking platform | |
| Shaking incubator | Labtech | Model: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 software | Systat Software Inc | For dose-response curve generation | |
| Sulforhodamine B powder | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Binding fluorescent dye for dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 reactions, no AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | 1000 reactions |
| Thermo CO2 incubator (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 °C and 5% CO2 incubation | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Trizma base | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Ultrapure water | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | For amplification of DNA (or cDNA) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 units/mL |
References
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Park, J. K., et al. MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy. Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).
- Henry, J. C., et al. miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).
- Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
- Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).
- Khoshinani, H. M., et al. Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line. Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).
- Gao, Y., et al. MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3. Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).
- Catanzaro, G., et al. Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs). International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).
- Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. The hunting of targets: challenge in miRNA research. Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).
- Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells. Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).
- Xia, X., et al. Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN. American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).
- Lee, K. H., et al. Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer. Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).
- van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes. 8, 47 (2015).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS One. 5 (4), e10202 (2010).
- Wu, L., Belasco, J. G. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).
- Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay. Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).
- Ma, Z., et al. Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation. Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).
- Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).
- Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches. Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).
- Lee, E. J., et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).
- Nuovo, G. J., et al. A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets. Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).
- Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44 (1), 31-38 (2008).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).
- Orellana, E. A., Kasinski, A. L. Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation. Bio Protocol. 6 (21), (2016).
- Lawrie, C. H. MicroRNAs in hematological malignancies. Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. MicroRNAs and anticancer drugs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).
- Moeng, S., et al. MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide. Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).
- Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).
- Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing. Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).
