Протокол In Vitro для оценки уровней, функций и связанных с ними целевых генов в опухолевых клетках
Summary
Этот протокол использует зонд на основе в режиме реального времени полимеразной цепной реакции (PCR), сульфорходамин B (SRB) обзор, 3’непереведенных регионов (3′ UTR) клонирования, и luciferase обзор для проверки целевых генов miRNA интереса и понять функции miRNAs.
Abstract
МикроРНК (миРНК) представляют собой небольшие регулятивные РНК, которые, как признается, модулируют многочисленные внутриклеточные сигнальные пути при нескольких заболеваниях, включая рак. Эти небольшие регулятивные РНК в основном взаимодействуют с 3”e’e’e’d (3′ UTR) их целевых РНК-мессенджера (mRNAs), что в конечном итоге приводит к ингибированию процессов декодирования мРНК и увеличению целевых деградаций мРНК. Основываясь на уровнях экспрессии и внутриклеточных функциях, миРНК могут служить регуляторными факторами онкогенных и опухолевых мРНК. Выявление добросовестных целевых генов miRNA среди сотен или даже тысяч вычислительно прогнозируемых целей является важным шагом для определения роли и основных молекулярных механизмов miRNA интереса. Для поиска возможных взаимодействий miRNA-mRNA доступны различные целевые программы miRNA. Однако, самый сложный вопрос заключается в том, как проверить прямые гены цели miRNA интереса. Этот протокол описывает воспроизводимую стратегию ключевых методов по определению целей miRNA, связанных с функцией miRNA. Этот протокол представляет практическое руководство по пошаговым процедурам, чтобы раскрыть уровни miRNA, функции, и связанные с ними целевые мРНК с использованием зонда на основе полимеразной цепной реакции (PCR), сульфорходамин B (SRB) обзор после miRNA имитировать трансфекции , генерация кривой дозы-реакции, и luciferase асссее наряду с клонированием 3′ UTR гена, который необходим для правильного понимания ролей отдельных miRNAs.
Introduction
МикроРНК (miRNAs) являются небольшие нормативные РНК, которые в основном модулировать процесс перевода и деградации посланникРН (мРНК) реагируя на 3”непереведенных регионов (3′ UTR) в добросовестных целевых генов1. Выражение миРНК может регулироваться транскрипционными и посттранскрипционными механизмами. Дисбаланс таких механизмов регулирования приносит неконтролируемые и отличительные уровни выражения miRNAs во многих заболеваниях, включая рак2. Одна miRNA может иметь несколько взаимодействий с различными мРНК. Соответственно, индивидуальная мРНК может контролироваться различными миРНК. Таким образом, внутриклеточные сигнальные сети замысловато влияют на четко выраженные миРНКи, с помощью которых физиологические расстройства и заболевания могут быть инициированы и ухудшились2,3,4, 5 , 6. Хотя измененное выражение miRNAs наблюдалось в различных типах рака, молекулярные механизмы которые модулируют образы раковых клеток в сочетании с miRNAs все еще больш неизвестны.
Накопление доказательств показывает, что онкогенные или опухолевые роли миРНК зависят от видов рака. Например, таргетинг вилочного ящика o3 (FOXO3), miR-155 способствует пролиферации клеток, метастазам и химиорезу колоректального рака7,8. В отличие от этого, ограничение вторжения клеток глиомы индуцируется miR-107 через регуляцию нейрогенного локуса выемки омологического белка 2 (NOTCH2) выражение9. Оценка miRNA-целевых взаимодействий в связи с функциями miRNA является неотъемлемой частью для лучшего понимания того, как miRNAs регулировать различные биологические процессы как в здоровых, так и в больных государствах10. Кроме того, открытие добросовестных целей (ы) miRNAs может дополнительно обеспечить доработанную стратегию для miRNA основе терапии с различными противораковыми препаратами. Однако основной проблемой в области миРНК является выявление прямых целей миРНК. Здесь подробные методы представлены в качестве воспроизводимых экспериментальных подходов к определению гена миРНК. Успешный экспериментальный дизайн для идентификации цели miRNA включает в себя различные шаги и соображения(рисунок 1). Сравнение зрелых уровней миРНК в опухолевых клетках и нормальных клетках может быть одной из распространенных процедур для выбора миРНК интереса(рисунок 1A). Функциональное исследование выбранной miRNA для обнаружения влияния miRNA на пролиферацию клеток важно сузить список лучших потенциальных целей кандидата на miRNA интереса(рисунок 1B). На основе экспериментально подтвержденных функций miRNAs, систематический обзор литературы и базы данных в компании с miRNA целевой программы прогнозирования требуется для поиска наиболее релевантной информации о функциях генов(рисунок 1C). Идентификация реальных генов цели miRNA интереса может быть достигнута путем осуществления экспериментов, таких как luciferase асссе наряду с клонированием 3′ UTR гена, в режиме реального времени ПЦР, и западной blotting(Рисунок 1D). Целью текущего протокола является обеспечение комплексных методов ключевых экспериментов, зонд на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), сульфорходамин B (SRB) после мирны имитировать трансфекции, доза-реакция кривой поколения, и люцифераза асссис вместе с клонированием 3′ UTR гена. Нынешний протокол может быть полезен для лучшего понимания функций отдельных miRNAs и последствия miRNA в терапии рака.
Protocol
Representative Results
Discussion
Стратегии определения добросовестных целей miRNA с функциями miRNA интересов необходимы для понимания нескольких ролей miRNA. Идентификация генов миРНК может быть ориентиром для интерпретации событий сигнализации клеток, модулируемых миРНК в клетке. Открытие функционально важных целевых г…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Программой фундаментальных научных исследований через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемый Министерством образования (2017R1D1A3B03035662); и Исследовательский фонд Галлимского университета, 2017 (HRF-201703-003).
Materials
| 15 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50050 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | |
| 6X DNA loading dye | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8-cap strip | Applied Biosystems | N8010535 | For cDNA synthesis |
| 8-tube strip | Applied Biosystems | N8010580 | For cDNA synthesis |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Acetic acid | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
| Ampicillin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 tube strips | Agilent Technologies | 401493 | For real time PCR |
| AriaMx real-time PCR system | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplification, detection, and data analysis |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 units/mL |
| CAPAN-1 cells | ATCC | HTB-79 | |
| Cell culture hood | Labtech | Model: LCB-1203B-A2 | |
| Counting chambers with V-slash | Paul Marienfeld | 650010 | Cells counter |
| CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | 10X concentration |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| DNA gel extraction kit | Bionics | DN30200 | 200 prep |
| DNA ladder | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb ladder |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 units |
| Dual-luciferase reporter assay system | Promega | E1910 | 100 assays |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT competent cells | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | Competent cells |
| HPNE cells | ATCC | CRL-4023 | |
| LB agar broth | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| Luminometer | Promega | Model: E5311 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Microplate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (electrophoresis system) | TaKaRa | Model: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 units/mL |
| Oligo explorer program | GeneLink | For primer design | |
| Optical tube strip caps (8X Strip) | Agilent Technologies | 401425 | For real time PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 cells | ATCC | CRL-1469 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Plasmid DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA polymerase | TaKaRa | R050A | 250 units |
| Shaker | TECAN | Shaking platform | |
| Shaking incubator | Labtech | Model: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 software | Systat Software Inc | For dose-response curve generation | |
| Sulforhodamine B powder | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Binding fluorescent dye for dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 reactions, no AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | 1000 reactions |
| Thermo CO2 incubator (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 °C and 5% CO2 incubation | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Trizma base | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Ultrapure water | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | For amplification of DNA (or cDNA) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 units/mL |
References
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Park, J. K., et al. MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy. Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).
- Henry, J. C., et al. miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).
- Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
- Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).
- Khoshinani, H. M., et al. Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line. Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).
- Gao, Y., et al. MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3. Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).
- Catanzaro, G., et al. Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs). International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).
- Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. The hunting of targets: challenge in miRNA research. Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).
- Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells. Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).
- Xia, X., et al. Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN. American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).
- Lee, K. H., et al. Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer. Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).
- van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes. 8, 47 (2015).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS One. 5 (4), e10202 (2010).
- Wu, L., Belasco, J. G. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).
- Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay. Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).
- Ma, Z., et al. Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation. Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).
- Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).
- Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches. Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).
- Lee, E. J., et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).
- Nuovo, G. J., et al. A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets. Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).
- Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44 (1), 31-38 (2008).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).
- Orellana, E. A., Kasinski, A. L. Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation. Bio Protocol. 6 (21), (2016).
- Lawrie, C. H. MicroRNAs in hematological malignancies. Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. MicroRNAs and anticancer drugs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).
- Moeng, S., et al. MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide. Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).
- Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).
- Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing. Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).
