Ett in vitro-protokoll för utvärdering av mikroRNA nivåer, funktioner och associerade målgener i tumörceller
Summary
Detta protokoll använder en sond-baserade realtid polymeras kedjereaktion (PCR), en sulforodamin B (SRB) assay, 3 ‘ oöversatta regioner (3 ‘ utr) kloning, och en luciferas analys för att kontrollera målgener av en Mirna av intresse och att förstå funktionerna i mirnas.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) är små reglerande RNAs som är erkända för att modulera många intracellulära signalvägar i flera sjukdomar inklusive cancer. Dessa små reglerande RNAs samverkar främst med 3 ‘ oöversatta regioner (3 ‘ UTR) av deras mål Messenger RNAs (mRNAs) i slutändan resulterar i hämning av avkodnings processer av mRNAs och förstärkning av Target mRNA degradations. Baserat på uttrycks nivåer och intracellulära funktioner, miRNAs kan fungera som reglerande faktorer för onkogena och tumör-suppressiv mRNAs. Identifiering av bona fide målgener av en miRNA bland hundratals eller till och med tusentals beräkningsmässigt förutspådda mål är ett viktigt steg för att urskilja rollerna och grundläggande molekylära mekanismer för en miRNA av intresse. Olika miRNA mål förutsägelse program finns tillgängliga för att söka möjliga miRNA-mRNA interaktioner. Men den mest utmanande frågan är hur man validerar direkta målgener av en miRNA av intresse. Detta protokoll beskriver en reproducerbar strategi av viktiga metoder för hur man identifierar miRNA mål relaterade till funktionen av en miRNA. Detta protokoll presenterar en praktisk vägledning om steg-för-steg-procedurer för att avslöja Mirna-nivåer, funktioner och relaterade mål-mrnas med hjälp av sond-baserade realtid polymeras kedjereaktion (PCR), sulforodamin B (SRB) assay efter en Mirna Mimic transfektion , dos-respons kurva generation, och luciferas assay tillsammans med kloning av 3 ‘ utr av en gen, vilket är nödvändigt för att korrekt förstå rollerna för enskilda mirnas.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) är de små reglerande RNAs som huvudsakligen modulera processen för översättning och nedbrytning av Messenger RNAs (mRNAs) genom att reagera på 3 ‘ oöversatta regioner (3 ‘ UTR) i bona fide målgener1. Uttryck för miRNAs kan regleras genom transkriptionella och posttranskriptionella mekanismer. Obalansen i sådana regleringsmekanismer ger okontrollerade och distinkta miRNAs-uttrycksnivåer i många sjukdomar, inklusive cancer2. En enda miRNA kan ha flera interaktioner med olika mRNAs. På motsvarande sätt kan en individuell mRNA styras av olika miRNAs. Därför är intracellulära signal nätverk intrikat influerade av tydligt uttryckt mirnas genom vilka fysiologiska störningar och sjukdomar kan initieras och försämras2,3,4, ,5 , 6. även om det förändrade uttrycket av mirnas har observerats i olika typer av cancer, de molekylära mekanismer som modulera sätt cancerceller i samband med mirnas är fortfarande till stor del okända.
Ackumulerande bevis har visat att de onkogena eller tumör-suppressiva roller miRNAs beror på vilka typer av cancer. Till exempel, genom att rikta forkhead Box O3 (FOXO3), Mir-155 främjar cellproliferation, metastaser, och kemoresistens av kolorektal cancer7,8. Däremot är begränsningen av gliom cell invasion induceras av Mir-107 via regleringen av neurogena Locus notch homolog protein 2 (NOTCH2) uttryck9. Bedömningen av miRNA-målinteraktioner i samband med miRNA-funktioner är en oumbärlig del för att bättre förstå hur miRNAs reglerar olika biologiska processer i både friska och sjuka stater10. Dessutom kan upptäckten av bona fide Target (s) av miRNAs ytterligare ge en finjusterad strategi för en miRNA-baserad behandling med olika läkemedel mot cancer. Den största utmaningen inom området miRNAs är dock att identifiera de direkta målen för miRNAs. Här presenteras detaljerade metoder som reproducerbara experimentella metoder för att fastställa miRNA-målgen. Framgångsrik experimentell design för miRNA Target identifiering omfattar olika steg och överväganden (figur 1). Jämförelse av mogna miRNA nivåer i tumörceller och normala celler kan vara en av de vanligaste förfarandena för att välja en miRNA av intresse (figur 1a). Den funktionella studie av en utvald miRNA att upptäcka effekterna av en miRNA på cellproliferation är viktigt att begränsa listan över bästa potentiella kandidat mål av en miRNA av intresse (figur 1b). Baserat på miRNAs experimentellt validerade funktioner krävs en systematisk genomgång av litteratur och databas i sällskap med ett miRNA-målprediktionsprogram för att söka den mest relevanta informationen om gen funktioner (figur 1c). Identifieringen av verkliga målgener av en Mirna av intresse kan uppnås genom att genomföra experiment som luciferas analysen tillsammans med kloning av 3 ‘ utr av en gen, realtid PCR, och Western blotting (figur 1d). Målet med det nuvarande protokollet är att tillhandahålla omfattande metoder för viktiga experiment, den sond-baserade realtid polymeras kedjereaktion (PCR), sulforodamin B (SRB) assay efter en Mirna Mimic transfektion, dos-respons kurva generation, och luciferas-analysen tillsammans med kloningen av 3 ‘ utr av en gen. Det nuvarande protokollet kan vara användbart för en bättre förståelse av funktionerna hos enskilda miRNAs och implikationen av en miRNA i cancerterapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Strategier för bestämning av bona fide miRNA mål med funktioner av en miRNA av intresse är oumbärliga för förståelsen av flera roller miRNAs. Identifiering av miRNA-målgener kan vara en riktlinje för tolkning av cellsignalering-händelser som modulateras av miRNAs i en cell. En avtäckningen av funktionellt viktiga målgener av miRNAs kan ge grundläggande kunskaper för att utveckla en miRNA-baserad terapi i cancer.
Flera metoder såsom Microarrays, små RNA-bibliotek sekvensering, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av Basic Science Research program genom National Research Foundation of Korea (NRF) som finansieras av undervisningsministeriet (2017R1D1A3B03035662); och Hallym universitetets forskningsfond, 2017 (HRF-201703-003).
Materials
| 15 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50050 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | |
| 6X DNA loading dye | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8-cap strip | Applied Biosystems | N8010535 | For cDNA synthesis |
| 8-tube strip | Applied Biosystems | N8010580 | For cDNA synthesis |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Acetic acid | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
| Ampicillin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 tube strips | Agilent Technologies | 401493 | For real time PCR |
| AriaMx real-time PCR system | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplification, detection, and data analysis |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 units/mL |
| CAPAN-1 cells | ATCC | HTB-79 | |
| Cell culture hood | Labtech | Model: LCB-1203B-A2 | |
| Counting chambers with V-slash | Paul Marienfeld | 650010 | Cells counter |
| CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | 10X concentration |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| DNA gel extraction kit | Bionics | DN30200 | 200 prep |
| DNA ladder | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb ladder |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 units |
| Dual-luciferase reporter assay system | Promega | E1910 | 100 assays |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT competent cells | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | Competent cells |
| HPNE cells | ATCC | CRL-4023 | |
| LB agar broth | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| Luminometer | Promega | Model: E5311 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Microplate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (electrophoresis system) | TaKaRa | Model: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 units/mL |
| Oligo explorer program | GeneLink | For primer design | |
| Optical tube strip caps (8X Strip) | Agilent Technologies | 401425 | For real time PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 cells | ATCC | CRL-1469 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Plasmid DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA polymerase | TaKaRa | R050A | 250 units |
| Shaker | TECAN | Shaking platform | |
| Shaking incubator | Labtech | Model: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 software | Systat Software Inc | For dose-response curve generation | |
| Sulforhodamine B powder | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Binding fluorescent dye for dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 reactions, no AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | 1000 reactions |
| Thermo CO2 incubator (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 °C and 5% CO2 incubation | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Trizma base | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Ultrapure water | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | For amplification of DNA (or cDNA) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 units/mL |
References
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Park, J. K., et al. MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy. Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).
- Henry, J. C., et al. miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).
- Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
- Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).
- Khoshinani, H. M., et al. Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line. Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).
- Gao, Y., et al. MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3. Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).
- Catanzaro, G., et al. Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs). International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).
- Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. The hunting of targets: challenge in miRNA research. Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).
- Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells. Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).
- Xia, X., et al. Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN. American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).
- Lee, K. H., et al. Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer. Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).
- van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes. 8, 47 (2015).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS One. 5 (4), e10202 (2010).
- Wu, L., Belasco, J. G. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).
- Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay. Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).
- Ma, Z., et al. Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation. Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).
- Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).
- Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches. Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).
- Lee, E. J., et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).
- Nuovo, G. J., et al. A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets. Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).
- Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44 (1), 31-38 (2008).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).
- Orellana, E. A., Kasinski, A. L. Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation. Bio Protocol. 6 (21), (2016).
- Lawrie, C. H. MicroRNAs in hematological malignancies. Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. MicroRNAs and anticancer drugs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).
- Moeng, S., et al. MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide. Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).
- Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).
- Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing. Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).
