בידוד וקוונפיקציה של וירוס Zika ממספר איברים בעכבר
Summary
המטרה של הפרוטוקול היא להדגים את הטכניקות המשמשות לחקירת מחלה נגיפית על ידי בידוד וכימות וירוס Zika, מאיברים מרובים בעכבר לאחר ההדבקה.
Abstract
השיטות המוצגות להפגין נוהלי מעבדה לבידוד איברים מבעלי חיים נגועים בנגיף Zika והקוונפיקציה של עומס ויראלי. מטרת ההליך היא לכמת מגדל נגיפי באזורים היקפיים ו-cn של העכבר בנקודות זמן שונות לכתוב זיהום או בתנאים ניסיוניים שונים כדי לזהות virologic גורמים אימונולוגיים המסדירים זיהום וירוס zika. הליכי בידוד האיברים הפגינו לאפשר שני מיקוד היווצרות הקוונפיקציה והערכת ה-PCR הכמותי של titers ויראלי. טכניקות בידוד איברים מהירה נועדו לשימור titer וירוס. כימות ויראלי על ידי מיקוד היווצרות היכולת מאפשר הערכה תפוקה מהירה של וירוס Zika. היתרון של ההתמקדות ביצירת מיקוד הוא הערכה של וירוס זיהומיות, המגבלה של היכולת הזאת היא הפוטנציאל רעילות איברים לצמצם את מגבלת הזיהוי. הערכת סיכוייו ויראלי משולב עם PCR כמותי, באמצעות רקומביננטי RNA העתק שליטה הגנום ויראלי מספר בתוך האיבר מוערך עם מגבלה נמוכה של זיהוי. באופן כללי טכניקות אלה מספקים שיטת תפוקה מדויקת במהירות גבוהה לניתוח של מגדל ויראלי בפריפריה ו-cn של בעלי חיים נגועים בווירוס zika והוא יכול להיות מיושם על הערכה של מגדל נגיפי באיברים של בעלי חיים נגועים ביותר פתוגנים, כולל נגיף דנגה.
Introduction
וירוס zika (zika) הוא מועבר השייכת המשפחה הפלחיות, אשר כולל פתוגנים אנושיים האנושית חשוב כגון powassan וירוס (powv), וירוס המוח היפני (jev), ומערב הנילוס וירוס (wnv)1. בעקבות בידוד וזיהוי, היו דיווחים תקופתיים על זיהומים zikv האדם באפריקה ואסיה2,3,4,5, ו מגיפות בתוך מרכז ודרום אמריקה (נבדקו ב הפניה6). עם זאת, לא היה עד לאחרונה כי ZIKV נחשב לגרום למחלה חמורה7. עכשיו יש אלפי מקרים של מחלות נוירולוגיות ופגמים בלידה מקושרים עם זיהומים ZIKV. הופעתה המהירה של ZIKV הונחה שאלות רבות הנוגעות: מדוע יש עלייה בחומרת המחלה, מהי התגובה החיסונית לזיהום ZIKV והם שם נגיפי ו/או הפתווגיות החיסונית מקושרים לעלייה נוירולוגית ביטויים ופגמים בלידה. עכשיו יש למהר להבין את מערכת העצבים המרכזית (cn) מחלה קשורה הקשורים ל-zikv, כמו גם את הצורך לבדוק במהירות את היעילות של נוגדנים וחיסונים נגד zikv. זה נגד הרקע הזה שפיתחנו שיטות לניתוח מהיר של zikv מגדל בפריפריה ו-cn באמצעות המוקד הספציפי zikv ליצור באמצעות בחני (ffa).
מודלים בעלי חיים קטנים חשובים להבנת התקדמות המחלה ולהערכה מוקדמת של חיסונים, therapeutics ואנטי ויראליים. הקמנו מודלים בעלי חיים קטנים לחקר מחלות מועבר באמצעות זנים שונים של העכבר כדי לדגמן זיהום האדם הגנה מפני פתוגנים נגיפי8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. באמצעות הניסיון הקודם הזה, התחלנו לשנות טכניקות המשמשות להערכת של wnv ו דנגה וירוס, flavivirus הקשורים להערכת zikv סיכוייו בשני איברים היקפיים, כמו גם את ה-cn21,23, 24. היתרונות של שיטות אלה בעלי האמצעים האחרים הם: 1) שהם משלבים את היכולת לקצור הן את אברי הפריפריה והן את איברי ה-cn לניתוח; 2) השיטות הן להתאמה עבור cy, להזרים לזרום, עבור מדידות של תגובות החיסונית מולדים מסתגלת, יחד עם מגדל נגיפי על אותה חיה באותו איבר; 3) טכניקת הקציר ניתנת להתאמה לניתוח היסטולוגית; 4) zikv ffa היא שיטת תפוקה גבוהה מהירה עבור ניתוח סיכוייו ויראלי; ו-5) שיטות אלה ניתן להחיל על הערכה של מגדל נגיפי באברי בעלי חיים נגועים ברוב פתוגנים25.
Protocol
Representative Results
Discussion
זיהום zikv יכול לגרום למחלה נוירולוגית ולכן מודלים בעלי חיים הנוכחי כדי ללמוד פתוגנזה, תגובות החיסון ויעילות הגנה של חיסונים נוגדנים צריך להתמקד בשליטה ויראלי בתוך ה-cn. אחד האתגרים בהתמקדות במחלת ה-CN הוא כי לעתים קרובות מגיע על חשבון לימוד זיהום היקפי. שיטות בידוד האיברים המוצעים כאן מתמקד ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ד ר פינטו ממומנת על ידי מענק זרע מאוניברסיטת סנט לואיס הספר לרפואה וכספים אתחול מאוניברסיטת סנט לואיס הספר לרפואה. ד ר Brien ממומן על ידי פרס החוקר המוקדם K22AI104794 מ-NIH NIAID כמו גם מענק זרע מבית הספר סנט לואיס אוניברסיטת. לכל האנשים הממומנים לא היה כל תפקיד בעיצוב הלמידה, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
Materials
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5ml eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose With 4500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5ml EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| o-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| one step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
References
- Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
- Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
- Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
- McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
- Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
- Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
- . Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
- Brien, J. D. . Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).
- Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).
- Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
- Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
- Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).
- Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
- Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).
- Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
- Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).
- Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
- Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).
