Farede Birden Fazla Organdan Zika Virüsünün İzolasyon ve Nicelikselleştirilmesi
Summary
Protokolün amacı, enfeksiyon sonrasında faredeki birden fazla organdan Zika virüsünü izole ederek ve ölçerek viral hastalıkları araştırmak için kullanılan teknikleri göstermektir.
Abstract
Sunulan yöntemler, zika virüsü bulaşmış hayvanlardan organların izole edilmesi ve viral yükün ölçülmesi için laboratuvar prosedürlerini göstermektedir. İşlemin amacı, zika virüs enfeksiyonunu düzenleyen virolojik ve immünolojik faktörleri belirlemek için farklı zaman noktalarında veya farklı deneysel koşullar altında farenin periferik ve CNS bölgelerindeki viral titreleri ölçmektir. Organ izolasyon prosedürleri hem odak lama nın hem de viral titrelerin kantitatif PCR değerlendirmesine olanak sağladığını göstermiştir. Hızlı organ izolasyon teknikleri virüs titresinin korunması için tasarlanmıştır. Odak oluşturarak analiz ile viral titreme quantification Zika virüsünün hızlı iş lenme değerlendirmesi için izin verir. Odak oluşturan testin yararı bulaşıcı virüsün değerlendirilmesidir, bu sadenin sınırlandırılması, tespit sınırını azaltan organ toksisitesi potansiyelidir. Viral titre değerlendirmesi kantitatif PCR ile birleştirilir ve organ içinde rekombinant RNA kopya kontrol viral genom kopya numarası kullanılarak algılama düşük sınırı ile değerlendirilir. Genel olarak bu teknikler, Zika virüsü enfekte hayvanların çevre ve CNS’lerinde Zika viral titrelerinin analizi için doğru bir hızlı yüksek iş elde etme yöntemi sağlar ve en çok enfekte olmuş hayvanların organlarındaki viral titrelerin değerlendirilmesinde uygulanabilir. patojenler, Dang virüsü de dahil olmak üzere.
Introduction
Zika virüsü (ZIKV) flaviviridae ailesine ait bir arbovirüstür, Powassan virüsü gibi önemli nöroinvaziv insan patojenleri içeren (POWV), Japon ensefalit virüsü (JEV), ve Batı Nil virüsü (WNV)1. İzolasyon ve tanımlamasının ardından, Afrika ve Asya’dainsan ZIKV enfeksiyonlarının periyodik raporları 2 ,3,4,5, ve Orta ve Güney Amerika’daki salgınhastalıklar ( referans6). Ancak, yakın zamana kadar ZIKV ciddihastalığaneden olduğu düşünüldü 7 değildi . Şimdi zikv enfeksiyonları ile bağlantılı nörolojik hastalık ve doğum kusurları vakaları binlerce vardır. ZIKV’nin hızlı bir şekilde ortaya çıkışı ile ilgili birçok soru yöneltti: neden hastalığın şiddetinde bir artış var, ZIKV enfeksiyonuna immünolojik yanıt nedir ve nörolojik artışa bağlı viral ve/veya immün aracılı patolojiler vardır? belirtileri ve doğum kusurları. Artık ZIKV ile ilişkili merkezi sinir sistemi (CNS) ile ilişkili hastalığı ve antivirallerin ve aşıların ZIKV’e karşı etkinliğini hızla test etme ihtiyacının anlaşılması için acele vardır. Zikv’e özgü odak lama tahlilleri (FFA) kullanarak hem çevre de hem de CNS’de ZIKV titrelerinin hızlı analizi için yöntemler geliştirdiğimiz bu zemine aykırıdır.
Küçük hayvan modelleri hastalığın ilerlemesini anlamak ve aşıların erken değerlendirilmesi için önemlidir, terapötik, ve anti-viral. Biz arbovirüs hastalığı nın çalışması için insan enfeksiyonu ve viral patojenlere karşı koruma modellemek için çeşitli fare suşları kullanarak küçük hayvan modelleri kurduk8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Bu önceki deneyimi kullanarak, wnv ve Dang virüsü, hem periferik organlarda zikv titresinin değerlendirilmesi için ilgili bir flavivirüs değerlendirilmesi için kullanılan teknikleri değiştirmeye başladı hem de CNS21,23, 24– Bu yöntemlerin diğer tahlillere göre avantajları şunlardır: 1) analiz için hem periferik hem de CNS organlarını toplama yeteneğini birleştirdikleri; 2) yöntemleri akış sitometri için uyarlanabilir, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık yanıtları ölçümleri için, aynı organda aynı hayvan üzerinde viral titreler ile birlikte; 3) hasat tekniği histolojik analiz için uyarlanabilir; 4) ZIKV FFA viral titreşme analizi için hızlı bir yüksek iş elde yöntemidir; ve 5) bu yöntemler en patojenler 25 ile enfekte hayvanlarınorganlarında viral titrelerin değerlendirilmesi için uygulanabilir .
Protocol
Representative Results
Discussion
ZIKV enfeksiyonu nörolojik bir hastalığa neden olabilir bu nedenle mevcut hayvan modellerinin patogenezi, immün yanıtları ve aşıların ve antivirallerin koruyucu etkinliğini incelemesi cns içinde viral kontrole odaklanması gerekir. CNS hastalığına odaklanmanın zorluklarından biri de genellikle periferik enfeksiyonu nitreşme pahasına gelmesidir. Burada önerilen organ izolasyon yöntemleri, CNS aracılı ZIKV ilişkili hastalığı değerlendirmek ve antivirallerin preklinik test için bir model oluştur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Pinto, Saint Louis Üniversitesi Tıp Fakültesi’nden bir tohum bağışı ve Saint Louis Üniversitesi Tıp Fakültesi’nden başlangıç fonları ile finanse edilmektedir. Dr. Brien, NIH NIAID’in K22AI104794 erken araştırmacı ödülü ve Saint Louis Üniversitesi Okulu’ndan bir tohum hibesi ile finanse edilmektedir. Finanse edilen tüm bireyler için fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, makalenin yayımlama kararı veya hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.
Materials
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5ml eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose With 4500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5ml EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| o-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| one step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
References
- Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
- Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
- Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
- McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
- Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
- Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
- . Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
- Brien, J. D. . Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).
- Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).
- Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
- Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
- Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).
- Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
- Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).
- Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
- Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).
- Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
- Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).
