Isolamento e quantificação do vírus Zika de múltiplos órgãos em um mouse
Summary
O objetivo do protocolo é demonstrar as técnicas utilizadas para investigar a doença viral, isolando e quantificando o vírus Zika, de múltiplos órgãos em um camundongo após a infecção.
Abstract
Os métodos apresentados demonstram procedimentos laboratoriais para o isolamento de órgãos de animais infectados pelo vírus Zika e a quantificação da carga viral. O objetivo do procedimento é quantificar os títulos virais em áreas periféricas e do SNC do camundongo em diferentes pontos temporais pós-infecção ou diferentes condições experimentais para identificar fatores virológicos e imunológicos que regulam a infecção pelo vírus Zika. Os procedimentos da isolação do órgão demonstraram permitem a quantificação do ensaio da formação do foco e a avaliação quantitativa do PCR de Titers virais. As técnicas rápidas da isolação do órgão são projetadas para a preservação do Titer do vírus. A quantificação do Titer viral pelo ensaio de conformação de foco permite a avaliação rápida da taxa de transferência do vírus Zika. O benefício do ensaio de formação de foco é a avaliação do vírus infeccioso, a limitação deste ensaio é o potencial para toxicidade de órgãos reduzindo o limite de detecção. A avaliação do Titer viral é combinada com o PCR quantitativo, e usar um número de cópia do genoma viral do controle da cópia do RNA recombinante dentro do órgão é avaliado com baixo limite de deteção. No geral, essas técnicas fornecem um método de alta taxa de transferência rápida e precisa para a análise dos títulos virais da Zika na periferia e no SNC dos animais infectados pelo vírus Zika e podem ser aplicados à avaliação de títulos virais nos órgãos de animais infectados com a maioria dos patogénicos, incluindo o vírus da dengue.
Introduction
O vírus Zika (ZIKV) é um arbovírus pertencente à família Flaviviridae, que inclui importantes patógenos humanos neuroinvasivos, como o vírus Powassan (POWV), o vírus da encefalite japonesa (JEV) e o vírus do Nilo Ocidental (WNV)1. Após seu isolamento e identificação, houve relatos periódicos de infecções humanas de zikv na África e na Ásia2,3,4,5e epidemias dentro da América Central e do Sul (revisada em referência6). Entretanto, não era até recentemente que o ZIKV estêve pensado para causar a doença severa7. Agora há milhares de casos de doença neurológica e defeitos congênitos ligados a infecções por ZIKV. A rápida emergência do ZIKV tem alertado para muitas questões relacionadas com: por que há um aumento na severidade da doença, qual é a resposta imunológica à infecção por ZIKV e existem patologias virais e/ou imunes mediadas ligadas ao aumento da manifestações e defeitos congênitos. Há agora uma pressa para compreender a doença relacionada do sistema nervoso central (CNS) associada com o ZIKV assim como a necessidade de testar ràpida a eficácia dos antivirais e das vacinas de encontro a ZIKV. É contra este pano de fundo que desenvolvemos métodos para a rápida análise dos títulos de ZIKV tanto na periferia como no SNC, utilizando um foco específico de ZIKV formando ensaios (FFA).
Os modelos animais pequenos são importantes para compreender a progressão da doença e para a avaliação adiantada das vacinas, da terapêutica, e dos anti-Virals. Nós estabelecemos modelos animais pequenos para o estudo da doença do arbovírus usando várias tensões do rato para modelar a infecção humana e a proteção de encontro aos micróbios patogénicos virais8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Usando essa experiência prévia, começamos a modificar as técnicas utilizadas para a avaliação do vírus da WNV e da dengue, um Flavivirus relacionado para a avaliação do titer de zikv em ambos os órgãos periféricos, bem como o SNC21,23, as vantagens 24. The destes métodos sobre outros ensaios são: 1) que combinam a habilidade de colher órgãos periféricos e do CNS para a análise; 2) os métodos são adaptáveis para a citometria de fluxo, para medições de respostas imunes inatas e adaptativas, juntamente com títulos virais no mesmo animal no mesmo órgão; 3) a técnica de colheita é adaptável para análise histológica; 4) o ZIKV FFA é um método rápido da taxa de transferência elevada para a análise viral do Titer; e 5) esses métodos podem ser aplicados à avaliação de títulos virais nos órgãos de animais infectados com a maioria dos patógenos25.
Protocol
Representative Results
Discussion
A infecção por ZIKV pode causar uma doença neurológica, portanto, os modelos animais atuais para estudar a patogênese, respostas imunes e eficácia protetora de vacinas e antivirais precisam se concentrar no controle viral dentro do SNC. Um dos desafios em focar na doença do SNC é que muitas vezes vem à custa de estudar a infecção periférica. Os métodos de isolamento de órgãos propostos aqui se centram na necessidade de avaliar rapidamente a infecção pelo ZIKV tanto na periferia quanto no SNC, a fim de av…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O Dr. pinto é financiado por uma bolsa de sementes da faculdade de medicina da Universidade de Saint Louis e fundos de arranque da faculdade de medicina da Universidade de Saint Louis. O Dr. Brien é financiado por um K22AI104794 prêmio de investigador precoce do NIH NIAID, bem como uma concessão de sementes da escola Saint Louis University. Para todos os indivíduos financiados, os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Materials
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5ml eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose With 4500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5ml EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| o-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| one step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
References
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