마우스의 여러 장기에서 Zika 바이러스의 격리 및 정량화
Summary
프로토콜의 목표는 감염 다음 마우스에 있는 다중 기관에서 Zika 바이러스를 격리하고 정량화하여 바이러스성 질병을 조사하기 위하여 이용된 기술을 설명하는 것입니다.
Abstract
제시되는 방법은 Zika 바이러스 감염 동물에서 기관의 격리 및 바이러스 부하의 정량화를 위한 실험실 절차를 보여줍니다. 절차의 목적은 Zika 바이러스 감염을 통제하는 선인장 및 면역학 요인을 확인하기 위하여 감염 후 또는 다른 시험 조건 의 밑에 다른 시점 에서 마우스의 말초 및 CNS 지역에 있는 바이러스 성 역가를 정량화하는 것입니다. 입증된 기관 격리 절차는 바이러스 성 적기의 초점 형성 분석 정량화 및 정량적 PCR 평가를 모두 허용합니다. 급속한 기관 격리 기술은 바이러스 적기의 보존을 위해 디자인됩니다. 포커스 형성 분석에 의한 바이러스 성 적정정화는 Zika 바이러스의 신속한 처리량 평가를 허용합니다. 초점 형성 분석법의 이점은 전염성 바이러스의 평가이며, 이 분석법의 한계는 검출의 한계를 감소시키는 장기 독성에 대한 잠재력이다. 바이러스 적대자 평가는 정량적 PCR과 결합되고, 재조합 RNA 카피 대조군 바이러스 게놈 카피 번호를 사용하여 기관 내의 검출한계가 낮아 평가된다. 전반적으로 이러한 기술은 Zika 바이러스 감염 동물의 주변 및 CNS에서 Zika 바이러스 적시의 분석을 위한 정확한 빠른 높은 처리량 방법을 제공하고 대부분의 감염된 동물의 장기에서 바이러스 적기의 평가에 적용될 수 있습니다. 뎅기열 바이러스를 포함한 병원체.
Introduction
지카바이러스(ZIKV)는 플라비리대 패밀리에 속하는 아보바이러스로, 포와산 바이러스(POWV), 일본 뇌염 바이러스(JEV), 웨스트 나일 바이러스(WNV) 1과 같은 중요한신경침형 인간 병원체를 포함한다. 그것의 고립 및 확인에 따라, 아프리카와 아시아에 있는 인간 ZIKV 감염의 정기적인 보고가 있었다 2, 3,4,5,및 중남미 내의 전염병 (검토에서 참조6). 그러나, ZIKV가 심각한 질병을 일으키는 것으로 생각되었다 최근까지아니었다7. 지금 ZIKV 감염에 연결된 신경질병 및 출생 결함의 케이스의 수천이 있습니다. ZIKV의 급속한 출현은 관련있는 많은 질문을 자극했습니다: 왜 질병 엄격에 있는 증가가, ZIKV 감염에 면역학적인 반응은 무엇이고 신경학상에 있는 증가에 연결되는 바이러스성 및/또는 면역 중재한 병리학이 있습니다 증상 및 출생 결함. 이제 ZIKV와 관련된 중추 신경계 (CNS) 관련 질병뿐만 아니라 ZIKV에 대한 항 바이러스 및 백신의 효능을 신속하게 테스트 할 필요성을 이해하기 위해 서두르고 있습니다. 이러한 배경에서 우리는 ZIKV 특이적 초점 성형 분석법(FFA)을 사용하여 주변및 CNS 모두에서 ZIKV 적규자를 신속하게 분석하는 방법을 개발했습니다.
작은 동물 모형은 질병 진행을 이해하고 백신, 치료및 항바이러스제의 초기 평가를 위해 중요합니다. 우리는 바이러스 성 병원체에 대한 인간의 감염과 보호를 모델링하기 위해 다양한 마우스 균주를 사용하여arbovirus 질병의 연구를위한 작은 동물 모델을 설립했다 8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. 이러한 사전 경험을 사용하여, 우리는 WNV 및 뎅기열 바이러스, 두 말초 기관뿐만 아니라 CNS21,23에서 ZIKV 이터의 평가를위한 관련 플라비 바이러스의 평가에 사용되는 기술을 수정하기시작했다. 24. 다른 분석에 비해 이러한 방법의 장점은 다음과 같습니다 : 1) 분석을 위해 말초 및 CNS 장기를 모두 수확하는 능력을 결합하는 것; 2) 방법은 같은 기관에서 동일한 동물에 바이러스 역가와 함께, 선천적 및 적응 면역 반응의 측정을위한 유세포 분석에 적응; 3) 수확 기술은 조직학적 분석에 적응할 수 있다; 4) ZIKV FFA는 바이러스 성가자 분석을위한 빠른 높은 처리량 방법입니다; 및 5) 이들 방법은 대부분의 병원체에 감염된 동물의 장기에서 바이러스 성 적수의평가에 적용될 수 있다(25).
Protocol
Representative Results
Discussion
ZIKV 감염은 신경 질환을 일으킬 수 있으므로 현재 동물 모델은 병인, 면역 반응 및 백신 및 항 바이러스의 보호 효능을 연구하기 위해 CNS 내의 바이러스 제어에 집중할 필요가 있다. CNS 질병에 초점에 있는 도전의 한가지는 말초 감염을 공부하는 비용으로 수시로 온다입니다. 여기에 제안된 기관 격리 방법은 CNS 중재ZIKV 관련 질병을 평가하고 항바이러스제, 치료 및 전임상 시험을 위한 모형을 확립…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
핀토 박사는 세인트 루이스 의과 대학의 종자 보조금과 세인트 루이스 의과 대학의 창업 기금으로 자금을 지원받습니다. Brien 박사는 NIH NIAID의 K22AI104794 초기 조사자 상과 세인트 루이스 대학 학교의 종자 보조금으로 자금을 지원받습니다. 모든 기금이 투자된 개인의 경우, 기금 모금자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을 하지 않았습니다.
Materials
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5ml eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose With 4500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5ml EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| o-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| one step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
References
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