Forberedelse af nyfødte rotte hjernevæv til Ultrastrukturel morfometrisk analyse af Synaptic Vesicle distribution på nerve terminaler

Summary

Vi beskriver procedurer for behandling af nyfødte rotte hjernevæv for at opnå højopløsnings elektron mikrografer til morfometrisk analyse af synaptisk vesikel fordeling ved nerve terminaler. Mikrograferne opnået med disse metoder kan også bruges til at studere morfologien af en række andre cellulære komponenter og deres dimensionale strukturelle relationer.

Abstract

Vores laboratorium og mange andre har udnyttet den høje løsning magt transmission elektronmikroskopi til at studere morfologi og rumlig organisering af synaptiske vesikler. For at opnå høj kvalitet elektron mikrografer, der kan give den grad af morfologiske detaljer er nødvendige for kvantitativ analyse af præ-synaptisk vesikel fordeling, optimal præparat præparat er kritisk. Kemisk fiksering er det første skridt i processen med præparat forberedelse, og af allerstørste betydning for at bevare fine ultrastruktur. Vaskulær fiksering med en glutaraldehyd-formaldehyd opløsning, efterfulgt af behandling af vibratome-sekerede prøver med osmium tetroxid, stabiliserer det maksimale antal molekyler, især proteiner og lipider, og resulterer i overlegen bevaring af ultrastruktur. Væv bliver derefter behandlet med modfarvning, sekventiel dehydrering og harpiks-Embedding. En bloc farvning med uranylnitrat acetat (dvs. farvning af vibratome-sekeret væv før harpiks indlejring) forbedrer endogene kontrast og stabiliserer celle komponenter mod ekstraktion under præparat behandling. Kontrasten kan øges yderligere ved at anvende uranylnitrat acetat som post pletten på ultratynde sektioner. Dobbelt farvning af ultratynde sektioner med bly citrat efter uranylnitrat acetat behandling forbedrer også billedopløsningen ved at intensivere elektron-opacitet af nukleinsyre-holdige strukturer gennem selektiv binding af bly til uranylnitrat acetat. Transmission elektronmikroskopi er et kraftfuldt værktøj til karakterisering af de morfologiske detaljer i synaptiske vesikler og kvantificering af deres størrelse og rumlige organisation i terminalens Bouton. Men, fordi det bruger fast væv, transmission elektronmikroskopi kan kun give indirekte oplysninger om levende eller udviklende processer. Derfor bør andre teknikker overvejes, når Hovedformålet er at studere dynamiske eller funktionelle aspekter af synaptisk blære handel og ekocytose.

Introduction

Vi beskriver metoder til fremstilling af nyfødte rotte hjernevæv for at opnå højkvalitets elektron mikrografer til dybdegående morfometrisk analyse af synaptisk vesikel rumlig fordeling ved nerve terminaler^1,2. De høj-kontrast mikrografer, der kan opnås ved at behandle prøver efter disse metoder kan også bruges til at studere den detaljerede morfologi af en række cellulære komponenter og deres dimensionale strukturelle relationer^3,4.

Transmission elektronmikroskop (TEM) er et kraftfuldt værktøj til at studere morfologien af organeller og andre cellulære strukturer kvantitativt. Som i dette årti, er der ingen andre metoder til undersøgelse, der kan give den samme grad af opløsning af lipid membraner og organeller uden immuno-tagging, med undtagelse af kryofiksering ved højt tryk frysning. Dog, fryse substitutions teknikker er ikke almindeligt anvendt, og normalt kræver dyrt udstyr og lange tilberedningstider.

For at kunne udnytte TEM-systemets høje opløsnings effekt er det yderst vigtigt at have et optimalt præparat. De vigtigste mål for præparat præparatet er at bevare vævs struktur med minimal ændring fra den levende tilstand, forbedre præparatet kontrast, og stabilisere vævet mod udvinding af cellulære komponenter under behandling og eksponering for elektron Stråle. Talrige protokoller for TEM væv forberedelse er blevet indført og perfektioneret af flere laboratorier i årenes løb. Mange af dem har fokuseret på metoder til optimal visualisering af synaptiske vesikler^{5,6,7,8,9,10,11}. Blandt en række veletablerede, guld standardmetoder, der i øjeblikket er i brug, valgte vi procedurer for kemisk fiksering, post fiksation, en bloc farvning, sekventiel dehydreringen, harpiks indlejringen og post farvning, der har til formål at bevare optimal vævs struktur og opnå fremragende billedkontrast. Bemærk, bevarelse af fin ultrastruktur kan være særligt udfordrende, når man arbejder med nyfødte rotte hjernevæv. Faktisk er det centrale nervesystem af meget unge dyr karakteriseret ved et højere vandindhold end den voksne hjerne, mere fremtrædende udvidelse af ekstracellulære rum, og løsere forbindelser mellem cellerne¹². Dette gør nyfødte rotte hjernevæv dybt følsom over for ændringer i osmolaritet, og udsøgt tilbøjelige til artifaktivt svind og/eller hævelse, når de behandles gennem sekventielle opløsninger af forskellige tonicitet¹². Derfor, vores metoder anvendes løsninger til præparat behandling, der er af osmolaritet så tæt som muligt på, at af rotte nyfødte hjernen. Vores mål var at opnå højkvalitets højopløsnings elektronmikroskopi billeder til kvantitativ vurdering af den synaptiske vesikel rumlige fordeling ved nerve terminaler. Specifikt, vi forsøgte at måle antallet af vesikler i nerve terminalen, afstanden af synaptiske vesikler fra den præ-synaptiske plasma membran, antallet af vesikler forankret i den præ-synaptiske membran, størrelsen af synaptiske vesikler og mellem vesikel afstande¹.

Tilfredsstillende kemisk fiksering er en forudsætning for at opnå højkvalitets elektron mikrografer, der kan give de morfologiske detaljer, der er nødvendige for at studere synaptisk blære morfologi og rumlig organisation. Selv om flere former for fiksering findes, fiksering af hjernevæv ved vaskulær perfusion er decideret overlegen i andre metoder. Da fiksering via vaskulær perfusion begynder umiddelbart efter anholdelsen af systemisk cirkulation, forkorter det intervallet mellem deoxygenering af hjernevæv og Cross-Linking af proteiner med fixativer, hvilket resulterer i minimum ændringer i celle Struktur. Desuden, det opnår hurtig og ensartet penetration, på grund af den hurtige strøm af fiksativ fra den vaskulære seng til ekstracellulære og cellulære rum^12,13,14. Primær fiksering med glutaraldehyd, efterfulgt af sekundær fiksering (efter fiksering) med osmium tetroxid, giver fremragende bevarelse af den fine struktur^15,16,17. En blanding af glutaraldehyd og PARAFORMALDEHYD har den yderligere fordel, at den hurtigere trænger ind i vævet¹².

Da biologisk væv ikke er tilstrækkelig stift til at blive skåret i tynde sektioner uden støtte fra en harpiks matrix, skal de integreres i et medium før tynde skæring. Vand-immiscible epoxyharpiks er almindeligt anvendt som et indlejrings medium i TEM. Når denne type matrix anvendes, skal hele prøveemnets frie vand udskiftes med et organisk opløsningsmiddel før harpiks infiltration. Vand fjernes ved at passere prøven gennem en række opløsninger af stigende koncentrationer af ethanol og/eller acetone¹². I denne protokol, er prøverne første flade indlejret mellem fleksible aklar ark, derefter indlejret i en kapsel. Det endelige resultat er væv placeret på spidsen af en cylindrisk harpiks blok, som har den ideelle geometri til at være mindst påvirket af vibrationer, der opstår under mikrotom skæring.

Farvning med tungmetaller til at forbedre endogene væv kontrast er et andet vigtigt aspekt af præparatet præparat. Billedkontrast i TEM skyldes elektron spredning af atomerne i vævet. Biologiske materialer består dog hovedsagelig af lavatomare molekyler (dvs. kulstof, brint, ilt og nitrogen). Derfor, dannelsen af tilstrækkelig spredning kontrast kræver inkorporering af høj atomare vægt atomer i cellulære komponenter i vævet. Dette opnås ved farvning af prøven med tungmetaller^12,18,19. Osmium tetroxide, uran og bly, som binder stærkt til lipider, er de mest almindelige tungmetaller, der anvendes som elektron pletter.

Osmium (atomnummer 76) er en af de tætteste metaller i eksistens. Det er både en fiksativ og en plet, selv om dens primære rolle i tem er som en pålidelig fikativ¹². Blandt de forskellige fikserings protokoller, der anvendes, er metoden med dobbelt fiksering med glutaraldehyd efterfulgt af osmium den mest effektive til at reducere udvindingen af cellebestanddele under præparat tilberedningen. Disse to aromastoffer bruges til at stabilisere det maksimale antal forskellige typer af molekyler, især proteiner og lipider, og resultere i overlegen bevaring af væv ultrastruktur^{12,14,15, 16} ud af ^, af ¹⁷.

Uran (atomnummer 92) er det tungeste metal, der anvendes som elektron pletter, oftest i form af uranylacetat. På samme måde som osmium, fungerer det som en plet og fikativ, selv om dets primære rolle i tem er som en plet^20,21. Nukleinsyre-holdige og membranøse strukturer er stærkt og fortrinsvis farves med uranylnitrat salte i aldehyd-faste væv^22,23. Behandling af væv med uranylnitrat acetat efter osmication og før dehydrering resulterer i stabilisering af membranøse og nukleinsyre-holdige strukturer, samt øget kontrast, og gør det muligt at identificere nogle strukturelle detaljer, der ikke ville let påvises i enheder plettet med osmium alene^12,24,25. Det menes, at uranylnitrat acetat kan stabilisere den fine struktur ved at kombinere med reduceret osmium, der er blevet deponeret på lipid membraner under osmication²⁴. Der opnås maksimal kontrast, når uranylnitrat acetat påføres før indlejring og som post pletten i tynde afsnit¹².

Bly (atomnummer 82) er den mest almindelige plet, der anvendes til TEM og er hovedsagelig beskæftiget med efter farvning af tynde sektioner. Blysalte har høj elektron opacitet og viser affinitet for en bred vifte af cellulære strukturer, herunder membraner, nukleare og cytoplasmatiske proteiner, nukleinsyre og glykogen^26,27. Når den dobbelte farvnings metode anvendes (dvs. farvning med uranylnitrat acetat efterfølges af behandling med bly), fungerer sidstnævnte som udvikler af uranylnitrat acetat farvning. For eksempel, bly post-farvning af kromatin fikseret med glutaraldehyd øger uranylnitrat acetat optagelse med en faktor på tre^{28,29,30,31,32}. Bly også forbedrer farvning overført af andre metaller såsom osmium. Det menes, at bly salte bejdsede membraner af osmium-faste væv ved at binde sig til Polar gruppen af phosphatidylphosphatider i nærværelse af reduceret osmium³³. En potentiel ulempe ved farvning med både uranylnitrat acetat og bly, især for længerevarende varigheder, er, at mange forskellige strukturelle elementer er plettet lige og ikke-specifikt, og derfor kan ikke let skelnes fra hinanden¹² .

Den nylige indførelse af alternative lyskilder, såsom i optisk super-opløsning foto-aktiveret lokalisering mikroskopi, har væsentligt forbedret lys mikroskopi opløsning³⁴. Men fordi let mikroskopi er afhængig af histokemiske og immun-cytokemiske metoder til at visualisere individuelt mærkede proteiner eller enzymer, er kraften i TEM til at vise alle strukturelle elementer på én gang stadig uovertruffen til dybtgående undersøgelse af morfologi og dimensionelle relationer af vævs strukturer. Især kan ingen anden teknik give de morfologiske detaljer, der er nødvendige for at udføre morfometrisk analyse af synaptisk vesikel fordeling på præ-synaptiske nerve boutoner. Ikke desto mindre er det vigtigt at bemærke, at elektron mikrografer fanger vævs strukturen, efter at organismen dør, og de kan derfor ikke give oplysninger om dynamikken i den præ-synaptiske vesikel-Handel og ekocytose. Derfor bør andre værktøjer, såsom FM Dye-levende billeddannelse og patch-klemme Elektrofysiologi, overvejes, når Hovedformålet er at studere dynamiske og/eller funktionelle aspekter af synaptisk vesikel Handel og exocytose.

Protocol

Alle undersøgelser blev godkendt af Institut for dyrepasning og-brug på University of Virginia (Charlottesville, VA) og gennemført i overensstemmelse med de nationale Institut for sundhed retningslinjer. 1. fiksering af vaskulær perfusion Bemærk: En generel beskrivelse af metoden for rotte hjerne vaskulær perfusion er allerede beskrevet i denne tidsskrift13 og ligger uden for denne protokols anvendelsesområde. Men følge…

Representative Results

Der er fastlagt generelle kriterier, som for det meste accepteres som tegn på tilfredsstillende eller mangelfuld konservering af enheden for TEM. Disse kriterier er eksemplificeret i fire udvalgte elektron mikrografer (to eksempler på optimal tilberedning, to eksempler på defekt præparat), som blev opnået ved at behandle unge rotte hjernevæv efter de metoder, der er beskrevet i denne protokol. Generelt fremstår en elektron Mikrograf af god kvalitet som en velordnet, tydelig og overordne…

Discussion

Håndtering af vævs sektioner under præparat forberedelsen til TEM kræver en betydelig grad af finesse, koncentration og tålmodighed. Når der anvendes en mikropipette til at tilføje og fjerne opløsninger, kan prøverne suges ind i pipettespidsen med overfladespænding, så der skal udvises stor omhu for at undgå vævsbeskadigelse af pipetten. Også, visse trin af dehydrering sekvens kan være så hurtig som 1 min, derfor operatøren har brug for at arbejde hurtigt for at sikre, at den næste dehydrering trin star…

Materials

4% Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19170	acqueous
50% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16310	EM grade, acqueous
Aclar 33 C embedding film	Electron Microscopy Sciences	50425-25	7.8 mil thickness, size 8"x10"
BEEM capsule holder	Electron Microscopy Sciences	69916	holds size "00" capsules
BEEM embedding capsules	Electron Microscopy Sciences	70021	size "00", flat
Butler block trimmer	Electron Microscopy Sciences	69945-01
Camel hair paint brush	Electron Microscopy Sciences	65576-01
Disc punch	Electron Microscopy Sciences	77850-09
Embed 812 kit	Electron Microscopy Sciences	14120
Lead acetate	Electron Microscopy Sciences	17600
Lead citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Lead nitrate	Electron microscopy Sciences	17900
Leica UC7 ultracut microtome	Leica
Micro scale	Electron Microscopy Sciences	62091-23
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19208	EM grade, granular
Precision Thelco laboratory oven	Thelco	51221159
Sodium azide	Sigma-Aldricht	S2002
StatMark pen	Electron Microscopy Sciences	72109-01
Tyrode solution	Electron Microscopy Sciences	11760-05
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	powder