तंत्रिका टर्मिनलों पर Synaptic आशय वितरण के Ultraस्ट्रक्चरल Morphometric विश्लेषण के लिए नवजात चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों की तैयारी
Summary
हम तंत्रिका टर्मिनलों पर synaptic आशय वितरण के morphometric विश्लेषण के लिए उच्च संकल्प इलेक्ट्रॉन micrographs प्राप्त करने के लिए नवजात चूहे मस्तिष्क ऊतक प्रसंस्करण के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन । इन पद्धतियों के साथ प्राप्त माइक्रोग्राफ भी अन्य सेलुलर घटकों की एक संख्या की आकृति विज्ञान और उनके आयामी संरचनात्मक संबंधों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
हमारी प्रयोगशाला और कई दूसरों के संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की आकृति विज्ञान और synaptic vesicles के स्थानिक संगठन का अध्ययन करने के उच्च समाधान शक्ति का दोहन किया है । आदेश में उच्च गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ कि पूर्व synaptic आशय वितरण के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए आवश्यक रूपात्मक विस्तार की डिग्री उपज सकते है प्राप्त करने के लिए, इष्टतम नमूना तैयारी महत्वपूर्ण है । रासायनिक स्थिरीकरण नमूना तैयार करने की प्रक्रिया में पहला कदम है, और अति महत्वपूर्ण ultrastructure को संरक्षित करने के लिए । एक ग्लूटाल्डिहाइड-फॉर्मलेडिहाइड विलयन के साथ संवहनी स्थिरीकरण, जिसके बाद वाइटोसोम-sectioned नमूनों के साथ आज़मियम tetroxide, अणुओं की अधिकतम संख्या को स्थिर, विशेष रूप से प्रोटीन और lipids, और बेहतर संरक्षण में परिणाम परासंरचना का । ऊतक तो counterstaining, अनुक्रमिक निर्जलीकरण और राल-embedding के साथ संसाधित है । En ब्लॉक यूरेनिल एसीटेट के साथ धुंधला (अर्थात, राल embedding से पहले vibratome-sectioned ऊतक के धुंधला) अंतर्जात कंट्रास्ट को बढ़ाता है और नमूना प्रसंस्करण के दौरान निष्कर्षण के खिलाफ सेल घटकों स्थिर । कंट्रास्ट को अल्ट्राथिन सेक्शनों पर एक के बाद एक दाग के रूप में यूरेनिल एसीटेट लगाने से और अधिक बढ़ाया जा सकता है । यूरेनिल एसीटेट उपचार के बाद सीसे साइट्रेट के साथ ultrathin वर्गों के डबल धुंधला हो जाना भी छवि संकल्प में सुधार, इलेक्ट्रॉन-न्यूक्लीय एसिड युक्त संरचनाओं के लिए नेतृत्व की चयनात्मक बंधन के माध्यम से की अस्पष्टता को तेज करके यूरेनिल एसीटेट । ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी synaptic पुटिकाओं और उनके आकार और स्थानिक संगठन के टर्मिनल bouton में मात्रा का परिमाण के रूपात्मक विवरण के लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । हालांकि, क्योंकि यह निश्चित ऊतक का उपयोग करता है, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी केवल अप्रत्यक्ष जानकारी प्रदान कर सकते है रहने या प्रक्रियाओं को विकसित करने के बारे में । इसलिए, अन्य तकनीकों पर विचार किया जाना चाहिए जब मुख्य उद्देश्य synaptic आशय की तस्करी और exocytosis के गतिशील या कार्यात्मक पहलुओं का अध्ययन करने के लिए है.
Introduction
हम नवजात चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों की तैयारी के लिए तरीकों का वर्णन करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रॉन micrographs प्राप्त करने के लिए synaptic आशय के में गहराई से रूपात्मक विश्लेषण तंत्रिका टर्मिनलों1,2में स्थानिक वितरण । इन पद्धतियों का अनुसरण करते हुए नमूनों के प्रक्रमण द्वारा प्राप्त किए जा सकने वाले उच्च-कंट्रास्ट माइक्रोग्राफ़ का उपयोग सेलुलर घटकों की संख्या और उनके आयामी संरचनात्मक संबंधों3,4के विस्तृत आकारिकी का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है ।
संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (TEM) एक शक्तिशाली उपकरण के लिए organelles और अंय सेलुलर संरचनाओं की आकृति विज्ञान का अध्ययन मात्रात्मक है । इस दशक के रूप में, वहाँ जांच की कोई अन्य तरीके हैं जो इम्यूनो-टैगिंग के बिना लिपिड झिल्ली और organelles के संकल्प की एक ही डिग्री प्रदान कर सकते हैं, उच्च दाब ठंड से cryofixation के अपवाद के साथ. हालांकि, स्थिर प्रतिस्थापन तकनीकों का व्यापक रूप से इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं, और आम तौर पर महंगे उपकरण और लंबी तैयारी बार की आवश्यकता है ।
आदेश में है TEM उच्च समाधान शक्ति का लाभ लेने के लिए, इष्टतम नमूना तैयारी सबसे महत्वपूर्ण है । नमूना तैयार करने के मुख्य लक्ष्य जीवित अवस्था से न्यूनतम परिवर्तन के साथ ऊतक संरचना को संरक्षित करना, नमूना कंट्रास्ट को बढ़ाना, और इलेक्ट्रॉन को संसाधित करने के दौरान सेलुलर घटकों के निष्कर्षण के विरुद्ध ऊतक को स्थिर करना है । बीम. TEM ऊतक तैयार करने के लिए कई प्रोटोकॉल शुरू कर दिया गया है और पिछले कुछ वर्षों में कई प्रयोगशालाओं द्वारा सिद्ध । उनमें से कई synaptic पुटिकाओं5,6,7,8,9,10,11के इष्टतम दृश्य के लिए तरीकों पर ध्यान केंद्रित किया है । अच्छी तरह से स्थापित की एक संख्या के अलावा, सोने के मानक तरीकों का उपयोग में वर्तमान में, हम रासायनिक निर्धारण, पद निर्धारण, एन ब्लॉक धुंधला, अनुक्रमिक निर्जलीकरण, राल embedding और पद धुंधला है कि इष्टतम ऊतक संरचना को संरक्षित करने के उद्देश्य के लिए प्रक्रियाओं को चुना है और उत्कृष्ट छवि कंट्रास्ट प्राप्त करना । नोट की, ठीक ultrastructure के संरक्षण विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है जब नवजात चूहा मस्तिष्क के ऊतकों के साथ काम कर रहे । वास्तव में, बहुत युवा जानवरों के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र वयस्क मस्तिष्क से अधिक पानी की सामग्री की विशेषता है, extracellular रिक्त स्थान के अधिक प्रमुख इज़ाफ़ा, और कोशिकाओं के बीच लूजर कनेक्शन12. यह नवजात चूहे मस्तिष्क ऊतक osmolarity में परिवर्तन करने के लिए गहराई से संवेदनशील बनाता है, और उत्कृष्ट विरूपण के लिए प्रवण और/ इसलिए, हमारे तरीके नमूना प्रसंस्करण के लिए समाधान नियोजित है कि परासारिता के रूप में चूहा नवजात मस्तिष्क के लिए संभव के रूप में बंद कर रहे हैं । हमारा लक्ष्य तंत्रिका टर्मिनलों पर synaptic आशय स्थानिक वितरण के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए उच्च गुणवत्ता, उच्च संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों को प्राप्त करने के लिए किया गया था । विशेष रूप से, हम तंत्रिका टर्मिनल के भीतर पुटिकाओं की संख्या को मापने की मांग की, पूर्व synaptic प्लाज्मा झिल्ली से synaptic पुटिकाओं की दूरी, पूर्व synaptic झिल्ली पर डॉक्ड पुटिकाओं की संख्या, synaptic पुटिकाओं के आकार और अंतर-पुटक दूरी1.
संतोषजनक रासायनिक नियतन उच्च गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ प्राप्त करने के लिए एक पूर्वापेक्षा है जो synaptic पुटिका आकारिकी और स्थानिक संगठन का अध्ययन करने के लिए आवश्यक रूपात्मक विस्तार प्रदान कर सकता है । यद्यपि कई प्रकार के नियतन विद्यमान हैं, तथापि संवहनी छिड़काव द्वारा मस्तिष्क के ऊतकों का स्थिरीकरण निश्चित रूप से अन्य पद्धतियों से बेहतर है । संवहनी छिड़काव के माध्यम से निर्धारण प्रणालीगत संचलन की गिरफ्तारी के बाद तुरंत शुरू होता है के बाद से, यह मस्तिष्क के ऊतकों के deoxygenation के बीच अंतराल को छोटा करता है और fixatives के साथ प्रोटीन की परस्पर जोड़ने, सेल में ंयूनतम परिवर्तन में जिसके परिणामस्वरूप संरचना. इसके अलावा, यह तेजी से और समान पैठ accomplishes, क्योंकि संवहनी बिस्तर से लगानेवाला के तेजी से प्रवाह के extracellular और सेलुलर डिब्बों12,13,14। ग्लूटाल्डिहाइड के साथ प्राथमिक स्थिरीकरण, आज़मियम tetroxide के साथ माध्यमिक निर्धारण (बाद निर्धारण) के बाद, ठीक संरचना15,16,17के उत्कृष्ट संरक्षण पैदावार । ग्लूटारल्डिहाइड और पैराफॉर्मैल्डिहाइड के मिश्रण से ऊतक12में अधिक तेजी से पैठ का अतिरिक्त लाभ होता है ।
के बाद से जैविक ऊतकों को पर्याप्त रूप से एक राल मैट्रिक्स के समर्थन के बिना पतली वर्गों में कटौती करने के लिए कठोर नहीं हैं, वे पतली sectioning से पहले एक माध्यम में एंबेडेड की जरूरत है । पानी-immiscible epoxy रेजिन सामांयतः TEM में एक embedding माध्यम के रूप में उपयोग किया जाता है । जब मैट्रिक्स के इस प्रकार का प्रयोग किया जाता है, सभी नमूना मुक्त पानी राल घुसपैठ से पहले एक कार्बनिक विलायक के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए । पानी को इथेनॉल के आरोही सांद्रता के समाधान की एक श्रृंखला के माध्यम से नमूना पारित करने से हटा दिया जाता है और/ इस प्रोटोकॉल में, नमूने पहले लचीला aclar चादरें, तो एक कैप्सूल में एंबेडेड के बीच एंबेडेड फ्लैट हैं । अंतिम परिणाम एक बेलनाकार राल ब्लॉक की नोक पर स्थित ऊतक है, जो आदर्श ज्यामिति के लिए कम हो माइक्रोटोम sectioning के दौरान उत्पंन होने वाले कंपन से प्रभावित है ।
अंतर्जात ऊतक कंट्रास्ट को बढ़ाने के लिए भारी धातुओं के साथ धुंधला होना नमूना तैयार करने का एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू है । प्रतिबिंब में चित्र के विपरीत, इलेक्ट्रॉन के परमाणुओं द्वारा ऊतक में प्रकीर्णन के कारण होता है । हालांकि, जैविक सामग्री मुख्यतः कम परमाणु वजन अणुओं (यानी, कार्बन, हाइड्रोजन, ऑक्सीजन और नाइट्रोजन) से मिलकर बनता है । अतः पर्याप्त प्रकीर्णन के विपरीत उच्च परमाणु भार परमाणुओं को ऊतक के कोशिकीय अवयवों में समाविष्ट करने की आवश्यकता होती है । यह भारी धातुओं के साथ नमूना के धुंधला के माध्यम से हासिल की है12,18,19। Osmium tetroxide, यूरेनियम और सीसा, जो lipids के लिए दृढ़ता से बाइंड, सबसे आम भारी धातुओं इलेक्ट्रॉन दाग के रूप में इस्तेमाल किया ।
Osmium (परमाणु संख्या ७६) के अस्तित्व में densest धातुओं में से एक है । यह दोनों एक लगानेवाला और एक दाग है, हालांकि tem में अपनी प्राथमिक भूमिका एक विश्वसनीय लगानेवाला12के रूप में है । उपयोग में विभिन्न निर्धारण प्रोटोकॉलों के अलावा, ओस्मियम के बाद ग्लूटार्ल्डिहाइड के साथ दोहरे निर्धारण की विधि नमूना तैयार करने के दौरान कोशिका अवयवों के निष्कर्षण को कम करने में सबसे अधिक प्रभावी है । इन दो फिक्टिव्स अणुओं के विभिंन प्रकार की अधिकतम संख्या को स्थिर करने के लिए उपयोग किया जाता है, विशेष रूप से प्रोटीन और lipids, और परिणाम ultrastructure ऊतक के बेहतर संरक्षण में12,14,15, 16 , १७।
यूरेनियम (परमाणु संख्या ९२) इलेक्ट्रॉन दाग के रूप में इस्तेमाल सबसे भारी धातु है, ज्यादातर यूरेनिल एसीटेट के रूप में आम तौर पर । इसी प्रकार osmium करने के लिए, यह एक दाग और fixative के रूप में कार्य करता है, हालांकि tem में अपनी प्राथमिक भूमिका एक20,21दाग के रूप में है । न्यूइक अम्ल-युक्त तथा झिल्लीदार संरचनाओं को ऐल्डिहाइड-नियत ऊतकों22,23में यूरेनिल लवण के साथ दृढ़ता से और अधिमान्य रूप से दाग दिया जाता है । ओस्फिकेशन के बाद और निर्जलीकरण से पहले यूरेनिल एसीटेट के साथ ऊतकों के उपचार झिल्ली और न्यूइक एसिड युक्त संरचनाओं के स्थिरीकरण में परिणाम, साथ ही बढ़ाया कंट्रास्ट, और कुछ संरचनात्मक विवरण है कि नहीं होगा की पहचान की अनुमति देता है अकेले आज़मियम के साथ दाग नमूनों में आसानी से पाया जा12,24,25। यह सोचा है कि यूरेनिल एसीटेट कम आज़मियम के साथ संयोजन द्वारा ठीक संरचना को स्थिर हो सकता है कि osmication के दौरान लिपिड झिल्ली पर जमा किया गया है24. अधिकतम कंट्रास्ट प्राप्त है जब यूरेनिल एसीटेट embedding से पहले लागू किया जाता है और एक पोस्ट के रूप में पतली वर्गों में दाग12।
सीसा (परमाणु संख्या ८२) सबसे आम TEM के लिए इस्तेमाल किया दाग है और मुख्य रूप से पतली वर्गों के बाद धुंधला के लिए कार्यरत है । सीसा लवण में उच्च इलेक्ट्रॉन अपारदर्शिता होती है तथा झिल्ली, नाभिकीय तथा साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन, न्यूक्लिइक अम्ल तथा ग्लाइकोजन26,27सहित अनेक कोशिकीय संरचनाओं के लिए अपनत्व प्रदर्शित होता है । जब डबल धुंधला विधि नियोजित है (यानी, यूरेनिल एसीटेट के साथ धुंधला नेतृत्व के साथ उपचार द्वारा पीछा किया है), यूरेनिल एसीटेट धुंधला के एक डेवलपर के रूप में काम करता है । उदाहरण के लिए, ग्लूटाराल्डिहाइड के साथ निर्धारित क्रोमेटिन कालीड पोस्ट-धुंधला हो जाना, तीन28,29,30,31,३२का एक कारक द्वारा यूरेनाइल एसीटेट तेज बढ़ जाता है । सीसा भी osmium के रूप में अंय धातुओं द्वारा प्रदान की जा रही धुंधला बढ़ाता है । यह माना जाता है कि सीसा लवण कम आज़मियम३३की उपस्थिति में फॉस्फिटाइड के ध्रुवीय समूह के लिए संलग्न द्वारा आज़मियम-फिक्स्ड ऊतकों की झिल्ली दाग । दोनों यूरेनिल एसीटेट और सीसा, विशेष रूप से लंबे समय तक durations के लिए के साथ धुंधला की एक संभावित नुकसान यह है कि कई अलग संरचनात्मक तत्वों को समान रूप से और गैर विशेष रूप से दाग रहे हैं, और इस तरह आसानी से एक दूसरे से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है12 .
इस तरह के ऑप्टिकल सुपर संकल्प फोटो सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी में के रूप में वैकल्पिक प्रकाश स्रोतों, की हाल ही में शुरू की है, काफी प्रकाश माइक्रोस्कोपी संकल्प३४सुधार हुआ है । हालांकि, क्योंकि प्रकाश माइक्रोस्कोपी के ऊतक-रसायन और प्रतिरक्षा साइटोकेमिकल तरीकों पर निर्भर करता है व्यक्तिगत रूप से कल्पना-प्रोटीन या एंजाइमों लेबल, tem की शक्ति को एक बार में सभी संरचनात्मक तत्वों को प्रदर्शित करने के लिए नायाब रहता है में गहराई से अध्ययन ऊतक संरचनाओं के आकारिकी और आयामी संबंध । विशेष रूप से, कोई अंय तकनीक में पूर्व synaptic तंत्रिका boutons पर synaptic आशय वितरण के रूपात्मक विश्लेषण करने के लिए आवश्यक रूपात्मक विस्तार प्रदान कर सकते हैं । फिर भी, यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि इलेक्ट्रॉन micrographs जीव मर जाता है के बाद ऊतक की संरचना पर कब्जा है, और इसलिए वे पूर्व synaptic पुटिका तस्करी और exocytosis की गतिशीलता के बारे में जानकारी प्रदान नहीं कर सकते । इसलिए, अंय उपकरण, जैसे एफएम डाई-लाइव इमेजिंग और पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, पर विचार किया जाना चाहिए जब मुख्य उद्देश्य synaptic आशय तस्करी और exocytosis के गतिशील और/या कार्यात्मक पहलुओं का अध्ययन करने के लिए है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
टीईएम के लिए नमूना तैयार करने के दौरान ऊतक वर्गों के हैंडलिंग में चालाकी, एकाग्रता और धैर्य की काफी मात्रा की आवश्यकता होती है । समाधान जोड़ने और निकालने के लिए एक micropipette का उपयोग करते हैं, नमूनों सतह तना?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस पांडुलिपि NIH द्वारा समर्थित किया गया/K08 १२३३२१ (करने के लिए N.L.) और वर्जीनिया के विश्वविद्यालय में Anesthesiology के विभाग से धन के द्वारा । लेखकों को उत्कृष्ट प्रशिक्षण और TEM के साथ तकनीकी सहायता, और उसके अमूल्य पांडुलिपि आलोचना के लिए के लिए Alev (जीव विज्ञान, वर्जीनिया, Charlottesville, VA के विश्वविद्यालय के विभाग) शुक्रिया अदा करना चाहता हूं । लेखक भी नमूना परिच्छेदन और बाद धुंधला के साथ तकनीकी सहायता के लिए वर्जीनिया विश्वविद्यालय में उंनत इलेक्ट्रॉन microscopy सुविधा का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | size "00", flat |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
References
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