Utarbeidelse av nyfødte Rat Brain tissue for ultrastructural Morphometric analyse av Synaptic vesicle fordeling på nerve terminaler

Summary

Vi beskriver prosedyrer for behandling av nyfødte rotte hjernen vev for å få høyoppløselig elektron micrographs for morphometric analyse av Synaptic vesicle distribusjon på nerve terminaler. Micrographs innhentet med disse metodene kan også brukes til å studere morfologi av en rekke andre cellulære komponenter og deres dimensjonale strukturelle relasjoner.

Abstract

Vårt laboratorium og mange andre har utnyttet den høye løse kraften i overføring elektron mikroskopi å studere morfologi og romlig organisering av Synaptic blemmer. For å oppnå høy kvalitet elektron micrographs som kan gi graden av morfologiske detaljer er nødvendig for kvantitativ analyse av pre-Synaptic vesicle fordeling, er optimal prøveforberedelse kritisk. Kjemisk fiksering er det første skrittet i prosessen med forberedelse av prøver, og av største viktighet for å bevare fin Ultrastructure. Vaskulær fiksering med en glutaraldehyde-formaldehyd løsning, etterfulgt av behandling av vibratome-delt prøver med Osmium tetroxide, stabiliserer maksimalt antall molekyler, spesielt proteiner og lipider, og resulterer i overlegen bevaring av Ultrastructure. Tissue blir deretter behandlet med counterstaining, sekvensiell dehydrering og harpiks-innebygging. En blokk farging med uranylnitratet acetate (dvs. farging av vibratome-delt vev før harpiks Embedding) forbedrer endogene kontrasten og stabiliserer celle komponenter mot ekstraksjon under prøve behandling. Kontrasten kan økes ytterligere ved å påføre uranylnitratet acetate som et post-flekken på ultratynne seksjoner. Double-farging av ultratynne seksjoner med bly citrate etter uranylnitratet acetate behandling også forbedrer bildeoppløsning, ved å intensivere elektron-opacity av nukleinsyre syre-inneholdende strukturer gjennom selektiv binding av bly til uranylnitratet acetate. Transmission Electron mikroskopi er et kraftig verktøy for karakterisering av morfologiske detaljer av Synaptic blemmer og kvantifisering av deres størrelse og romlig organisasjon i terminalen Bouton. Men fordi den bruker fast vev, kan overføring elektron mikroskopi bare gi indirekte informasjon om levende eller utviklende prosesser. Derfor bør andre teknikker vurderes når Hovedmålet er å studere dynamiske eller funksjonelle aspekter av Synaptic vesicle smugling og exocytosis.

Introduction

Vi beskriver metoder for utarbeidelse av nyfødte rotte hjernevev for å oppnå høy kvalitet elektron micrographs for grundig morphometric analyse av Synaptic vesicle romlig fordeling på nerve terminaler^1,2. Høy kontrast micrographs som kan oppnås ved å behandle prøver som følge av disse metodene kan også brukes til å studere den detaljerte morfologi av en rekke cellulære komponenter og deres dimensjonale strukturelle forhold^3,4.

Overføringen elektronmikroskop (TEM) er et kraftig verktøy for å studere morfologi av organeller og andre cellulære strukturer kvantitativt. Fra og med dette tiåret, er det ingen andre metoder for etterforskning som kan gi samme grad av oppløsning av lipid membraner og organeller uten Immuno-merking, med unntak av cryofixation ved høyt trykk frysing. Men fryse substitusjon teknikker er ikke mye brukt, og normalt krever dyrt utstyr og lang forberedelse ganger.

For å dra nytte av TEM høy løse kraft, er optimal prøveforberedelse av største betydning. De viktigste målene for prøven forberedelse er å bevare vev struktur med minimal endring fra den levende tilstand, forbedre prøven kontrast, og stabilisere vevet mot ekstraksjon av cellulære komponenter under behandling og eksponering for elektron Stråle. Tallrike protokoller for TEM-vevs forberedelser har blitt innført og perfeksjonert av flere laboratorier gjennom årene. Mange av dem har fokusert på metoder for optimal visualisering av Synaptic blemmer^5,6,⁷,⁸,^9,10,11. Blant en rekke veletablerte, gull standard metoder som er i bruk, vi valgte prosedyrer for kjemisk fiksering, post fiksering, en blokk farging, sekvensiell dehydrering, harpiks innebygging og post flekker som tar sikte på å bevare optimal vev struktur og oppnå utmerket bilde kontrast. Av notatet, bevaring av fine Ultrastructure kan være spesielt utfordrende når du arbeider med nyfødte rotte hjernevev. Faktisk er det sentrale nervesystemet av svært unge dyr preget av en høyere vanninnhold enn den voksne hjernen, mer fremtredende utvidelse av ekstracellulære mellomrom, og løsere forbindelser mellom cellene¹². Dette gjør nyfødt rotte hjernevev dypt følsomme for endringer i OSMOLARITETSSYSTEM, og utsøkt utsatt for artifactual krymping og/eller hevelse når de behandles gjennom sekvensielle løsninger av ulike tonisitet¹². Derfor våre metoder ansatt løsninger for prøve behandling som er av OSMOLARITETSSYSTEM så nær som mulig til at av rotte nyfødte hjernen. Vårt mål var å få høykvalitets, høyoppløselig elektron mikroskopi bilder for kvantitativ vurdering av Synaptic vesicle romlig distribusjon på nerve terminaler. Nærmere bestemt har vi søkt å måle antall blemmer i nerve terminalen, avstanden Synaptic blemmer fra pre-Synaptic plasma membran, antall blemmer forankret på pre-Synaptic membran, størrelsen på Synaptic blemmer og mellom vesicle avstander¹.

Tilfredsstillende kjemisk fiksering er en forutsetning for å oppnå høykvalitets elektron micrographs som kan gi de morfologiske detaljer som er nødvendige for å studere Synaptic vesicle morfologi og romlig organisasjon. Selv om flere moduser av fiksering eksisterer, fiksering av hjernevev ved vaskulær blod er desidert overlegen andre metoder. Siden fiksering via vaskulær blod starter umiddelbart etter arrestasjonen av systemisk sirkulasjon, forkorter det intervallet mellom deoxygenation av hjernevevet og krysskobling av proteiner med fiksativene, noe som resulterer i minimale endringer i celle Struktur. Videre oppnår det rask og ensartet penetrasjon, på grunn av den raske flyten av bindemiddel fra vaskulær seng til ekstracellulære og cellulære rom^12,13,14. Primær fiksering med glutaraldehyde, etterfulgt av sekundær fiksering (etter fiksering) med Osmium tetroxide, gir utmerket bevaring av den fine strukturen^15,16,17. En blanding av glutaraldehyde og paraformaldehyde har den ekstra fordelen av raskere penetrasjon inn i vevet¹².

Siden biologisk vev ikke er tilstrekkelig stive til å bli skåret i tynne seksjoner uten støtte fra en harpiks matrise, må de bygges inn i et medium før tynn snitting. Vann-ublandbare epoxy harpiks er ofte brukt som en embedding medium i TEM. Når denne typen matrise brukes, må alle prøve fritt vann erstattes med et organisk løsemiddel før harpiks infiltrasjon. Vann fjernes ved å sende prøven gjennom en rekke løsninger av stigende konsentrasjoner av etanol og/eller aceton¹². I denne protokollen, prøvene er første flat innebygd mellom fleksible aclar ark, deretter innebygd i en kapsel. Det endelige resultatet er vev som ligger på spissen av en sylindrisk harpiks blokk, som har den ideelle geometrien til å være minst påvirket av vibrasjoner som oppstår under mikrotomen snitting.

Farging med tungmetaller for å forbedre endogene vev kontrasten er en annen viktig del av prøven forberedelse. Bildekontrasten i TEM skyldes elektron spredning av atomer i vevet. Imidlertid består biologiske materialer i stor grad av lav Atom vekt molekyler (dvs. karbon, hydrogen, oksygen og nitrogen). Derfor krever generering av tilstrekkelig spredning kontrast inkorporering av høy Atomic vekt atomer i cellulære komponenter av vevet. Dette oppnås gjennom farging av prøven med tungmetaller^12,18,19. Osmium tetroxide, uran og bly, som binder sterkt til lipider, er de vanligste tungmetaller brukes som elektron flekker.

Osmium (atomnummer 76) er en av de tetteste metaller i eksistens. Det er både en bindemiddel og en flekk, selv om den primære rolle i TEM er som en pålitelig bindemiddel¹². Blant ulike fiksering protokoller i bruk, metoden for dobbel fiksering med glutaraldehyde etterfulgt av Osmium er den mest effektive i å redusere ekstraksjon av celle bestanddeler under prøven forberedelse. Disse to fiksativene brukes til å stabilisere det maksimale antall ulike typer molekyler, spesielt proteiner og lipider, og resultere i overlegen bevaring av vev Ultrastructure^{12,14,15, 16} flere ^{, 17}av dem.

Uran (atomnummer 92) er det tyngste metallet som brukes som elektron beis, vanligvis i form av uranylnitratet acetate. På samme måte som Osmium, fungerer den som en flekk og bindemiddel, selv om den primære rolle i tem er som en flekk på^20,21. Nukleinsyre acid-inneholdende og membranous strukturer er sterkt og fortrinnsvis beiset med uranylnitratet salter i aldehyd-faste vev^22,23. Behandling av vev med uranylnitratet acetate etter osmication og før dehydrering resulterer i stabilisering av membranous og nukleinsyre syre-inneholdende strukturer, så vel som forbedret kontrast, og tillater identifisering av noen strukturelle detaljer som ikke ville lett oppdages i prøver beiset med Osmium alene^12,24,25. Det er antatt at uranylnitratet acetate kan stabilisere den fine strukturen ved å kombinere med reduserte Osmium som har blitt avsatt på lipid membraner under osmication²⁴. Maksimal kontrast oppnås når uranylnitratet acetate påføres før embedding og som en post-flekken i tynne seksjoner¹².

Bly (Atomic nummer 82) er den vanligste flekken som brukes for TEM og er hovedsakelig ansatt for post-farging av tynne seksjoner. Bly salter har høy elektron tetthet og viser affinitet for et bredt spekter av cellulære strukturer, inkludert membraner, kjernefysiske og cytoplasmatiske proteiner, nukleinsyre syrer og glykogen^26,27. Når den doble farging metoden er ansatt (dvs. farging med uranylnitratet acetate etterfølges av behandling med bly), sistnevnte fungerer som en utvikler av uranylnitratet acetate farging. For eksempel, bly post-farging av kromatin fast med glutaraldehyde øker uranylnitratet acetate opptak av en faktor på tre^{28,29,30,31,32}. Bly også forbedrer farging formidles av andre metaller som Osmium. Det er antatt at bly salter flekker på membraner av Osmium-fast vev ved å feste til Polar gruppen av fosfatid i nærvær av reduserte Osmium³³. En potensiell ulempe for farging med både uranylnitratet acetate og bly, spesielt for langvarig varighet, er at mange ulike strukturelle elementer er farget likt og ikke-spesielt, og dermed kan ikke være lett skilles fra hverandre¹² .

Den nylige innføringen av alternative lyskilder, slik som i optisk super oppløselig bilde-aktivert lokalisering mikroskopi, har betydelig forbedret lys mikroskopi oppløsning³⁴. Men fordi lys mikroskopi er avhengig av histochemical og immune-cytokjemiske metoder for å visualisere individuelt merkede proteiner eller enzymer, er kraften i TEM å vise alle strukturelle elementer samtidig uovertruffen for dyptgående studie av morfologi og dimensjonale relasjoner av vev strukturer. Spesielt ingen annen teknikk kan gi morfologiske detaljer er nødvendig for å utføre morphometric analyse av Synaptic vesicle distribusjon på pre-Synaptic nerve boutons. Likevel er det viktig å merke seg at elektron micrographs fange strukturen i vevet etter at organismen dør, og derfor kan de ikke gi informasjon om dynamikken i pre-Synaptic vesicle smugling og exocytosis. Derfor bør andre verktøy, slik som FM Dye-Live Imaging og patch-Clamp elektrofysiologi, vurderes når Hovedmålet er å studere dynamiske og/eller funksjonelle aspekter ved Synaptic vesicle smugling og exocytosis.

Protocol

Alle studier ble godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee ved University of Virginia (Charlottesville, VA) og gjennomføres i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer. 1. fiksering av vaskulær Merk: En generell beskrivelse av metoden for rotte hjernen vaskulær blod er allerede beskrevet i denne tidsskriftet13 og er utenfor omfanget av denne protokollen. Men følgende trinn er spesifikke for uta…

Representative Results

Generelle kriterier som for det meste aksepteres som en indikasjon på tilfredsstillende eller defekt bevaring av prøve for TEM er fastslått. Disse kriteriene er eksempler på fire utvalgte elektron micrographs (to eksempler på optimal forberedelse, to eksempler på defekt forberedelse) som ble oppnådd ved å behandle unge rotte hjernevev etter metodene som er beskrevet i denne protokollen. Generelt, en god kvalitet elektronmikroskop vises som en ryddig, distinkt og generell grå bilde. I …

Discussion

Håndtering av vevs deler under prøveforberedelse for TEM krever en betydelig grad av finesse, konsentrasjon og tålmodighet. Når du bruker en micropipette til å legge til og fjerne løsninger, kan prøver suges inn i pipette spissen ved overflatespenning, så stor forsiktighet bør tas for å unngå vevskader av pipette. Også visse trinn av dehydrering sekvensen kan være så rask som 1 min, derav operatøren må arbeide raskt for å sikre at neste dehydrering trinn er startet på tid og prøven ikke tørr eller ryn…

Materials

4% Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19170	acqueous
50% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16310	EM grade, acqueous
Aclar 33 C embedding film	Electron Microscopy Sciences	50425-25	7.8 mil thickness, size 8"x10"
BEEM capsule holder	Electron Microscopy Sciences	69916	holds size "00" capsules
BEEM embedding capsules	Electron Microscopy Sciences	70021	size "00", flat
Butler block trimmer	Electron Microscopy Sciences	69945-01
Camel hair paint brush	Electron Microscopy Sciences	65576-01
Disc punch	Electron Microscopy Sciences	77850-09
Embed 812 kit	Electron Microscopy Sciences	14120
Lead acetate	Electron Microscopy Sciences	17600
Lead citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Lead nitrate	Electron microscopy Sciences	17900
Leica UC7 ultracut microtome	Leica
Micro scale	Electron Microscopy Sciences	62091-23
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19208	EM grade, granular
Precision Thelco laboratory oven	Thelco	51221159
Sodium azide	Sigma-Aldricht	S2002
StatMark pen	Electron Microscopy Sciences	72109-01
Tyrode solution	Electron Microscopy Sciences	11760-05
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	powder