Здесь мы представляем несколько простых методов оценки жизнеспособности и смерти в 3D раковых клеточных сфероидах, которые имитируют физико-химические градиенты опухолей in vivo гораздо лучше, чем 2D-культура. Таким образом, сфероидная модель позволяет оценить эффективность препарата от рака с улучшенным переводом в условия in vivo.
Трехмерные сфероиды раковых клеток являются важными инструментами как для рака наркотиков экраны и для получения механистического понимания биологии раковых клеток. Сила этого препарата заключается в его способности имитировать многие аспекты in vivo условия опухолей, будучи быстрым, дешевым и универсальным достаточно, чтобы позволить относительно высокой пропускной способности скрининга. Условия сфероидной культуры могут резюмировать физико-химические градиенты в опухоли, включая повышение внеклеточной кислотности, увеличение лактата и снижение доступности глюкозы и кислорода, от сфероидной периферии до ее ядра. Кроме того, механические свойства и клеточные взаимодействия опухолей in vivo частично передразнятся этой моделью. Специфические свойства и, следовательно, оптимальные условия роста 3D-сфероидов сильно различаются между различными типами раковых клеток. Кроме того, оценка жизнеспособности клеток и смерти в 3D сфероидах требует методов, которые частично отличаются от тех, которые используются для 2D культур. Здесь мы описываем несколько протоколов для подготовки 3D сфероидов раковых клеток, а также для использования таких культур для оценки жизнеспособности клеток и смерти в контексте оценки эффективности противораковых препаратов.
Использование многоклеточных моделей сфероидов в биологии рака несколько десятилетий старых1,2, но получил значительный импульс в последние годы. В значительной степени это отражает повышение осведомленности о том, насколько сильно фенотип раковых клеток зависит от их микросреды и специфических условий роста. Микросреда при твердых опухолях принципиально отличается от той, что в соответствующих нормальных тканях. Это включает в себя физико-химические условия, такие как рН, кислородное напряжение, а также интерстициальное давление, градиенты концентрации растворимых факторов, таких как питательные вещества, отходы и секретированные сигнальные соединения (факторы роста, цитокины). Кроме того, она включает в себя организацию внеклеточной матрицы (ECM), клеточных взаимодействий и межклеточной сигнализации, а также другие аспекты конкретной трехмерной (3D) архитектуры опухоли3,4, 5,6. Специфические микроэкологические условия, в которых существуют раковые клетки, глубоко влияют на их профиль экспрессии генов и функциональные свойства, и ясно, что, по сравнению с клетками, выращенными в 2D, фенотип 3D сфероидов гораздо более точно имитирует что из in vivo опухолей7,8,9,10,11. 2D модели, даже если они используют гипоксию, кислый рН и высокие концентрации лактата, чтобы имитировать известные аспекты микроокружения опухоли, по-прежнему не в состоянии захватить градиенты физико-химических параметров, возникающих в опухолях, а также их 3D опухоли Архитектура. С другой стороны, модели животных являются дорогостоящими, медленными и этически проблематичными, и, как правило, также имеют недостатки в их способности переизгладить условия опухоли человека. Следовательно, 3D сфероиды были применены в качестве промежуточной модели сложности висследованиях широкого спектра свойств большинства твердых раковых заболеваний 9,11,12,13, 14,15,16,17.
Широко используется 3D сфероиды в скрининговых анализов противораковой терапии эффективность9,18,19,20. Реакции на лечение особенно чувствительны к микроокружению опухоли, отражая как влияние мучительности, ограниченное диффузии, высокое интерстициальное давление, и кислый рН окружающей среды на доставку лекарств, так и влияние гипоксии и других аспекты микроокружения на реакции смерти клетки9,17. Потому что окружающая среда в 3D сфероиды по своей сути развивает все эти свойства7,8,9,10,11, используя 3D-клеточные культуры могут существенно улучшить перевод результатов в условия in vivo, но позволит ьсядую эффективную и доступную высокую пропускную работу скрининга чистого роста. Тем не менее, подавляющее большинство исследований по лекарственной реакции раковых клеток по-прежнему проводятся в 2D условиях. Это, вероятно, отражает, что, в то время как некоторые анализы могут относительно легко быть реализованы для 3D-клеточных культур, многие, такие как анализы жизнеспособности, западные промотирование, и иммунофлуоресценции анализа, гораздо удобнее сделать в 2D, чем в 3D.
Цель юрисовской работы заключается в предоставлении легко поддающихся капсулам анализов и точных протоколов анализа влияния лечения противораковыми препаратами на жизнеспособность раковых клеток и выживание в 3D-опухоли, имитирующей обстановку. В частности, мы предоставляем и сравниваем три различных метода формирования сфероидов, за которыми следуют методы качественного и количественного анализа роста, жизнеспособности и реакции на лекарства.
Использование 3D раковых клеток сфероидов оказался ценным и универсальным инструментом не только для скрининга противораковых препаратов, но и для получения механистического понимания регуляции смерти раковых клеток и жизнеспособности в условиях, имитирующих тех, кто в опухоли Микро…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны Катрин Франклин Марк и Аннет Бартельс за отличную техническую помощь и Асбьёрн Нёр-Нильсен за проведение экспериментов на рисунке 1D. Эта работа была профинансирована Фондом Эйнара Виллумсена, Фондом Ново Нордиска и Фондом Juchum (все в SFP).
2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |