Évaluation de la viabilité cellulaire et de la mort dans les cultures sphéroïdes 3D des cellules cancéreuses
Summary
Ici, nous présentons plusieurs méthodes simples pour évaluer la viabilité et la mort dans les sphéroïdes 3D de cellules cancéreuses, qui imitent les gradients physico-chimiques des tumeurs in vivo beaucoup mieux que la culture 2D. Le modèle sphéroïde permet donc d’évaluer l’efficacité du médicament contre le cancer avec une meilleure traduction aux conditions in vivo.
Abstract
Les sphéroïdes tridimensionnels des cellules cancéreuses sont des outils importants pour les deux dépistages de médicaments anticancéreux et pour obtenir un aperçu mécaniste de la biologie des cellules cancéreuses. La puissance de cette préparation réside dans sa capacité à imiter de nombreux aspects des conditions in vivo des tumeurs tout en étant rapide, bon marché, et assez polyvalent pour permettre un dépistage relativement à haut débit. Les conditions de culture sphéroïde peuvent récapituler les gradients physico-chimiques dans une tumeur, y compris l’acidité extracellulaire croissante, le lactate accru, et la disponibilité décroissante de glucose et d’oxygène, de la périphérie sphéroïde à son noyau. En outre, les propriétés mécaniques et les interactions cellule-cellule des tumeurs in vivo sont en partie imitées par ce modèle. Les propriétés spécifiques et par conséquent les conditions optimales de croissance, des sphéroïdes 3D, diffèrent considérablement entre les différents types de cellules cancéreuses. En outre, l’évaluation de la viabilité cellulaire et de la mort chez les sphéroïdes 3D nécessite des méthodes qui diffèrent en partie de celles employées pour les cultures 2D. Ici nous décrivons plusieurs protocoles pour préparer les sphéroïdes 3D des cellules cancéreuses, et pour l’utilisation de telles cultures pour évaluer la viabilité et la mort de cellules dans le contexte d’évaluer l’efficacité des drogues anticancéreuses.
Introduction
L’utilisation de modèles sphéroïdes multicellulaires en biologie du cancer est de plusieurs décennies1,2, mais a gagné un élan substantiel ces dernières années. Cela reflète en grande partie une prise de conscience accrue de la façon dont le phénotype des cellules cancéreuses dépend fortement de leur microenvironnement et de leurs conditions de croissance spécifiques. Le microenvironnement dans les tumeurs pleines est fondamentalement différent de celui dans les tissus normaux correspondants. Cela comprend les conditions physico-chimiques telles que le pH, la tension de l’oxygène, ainsi que la pression interstitielle, les gradients de concentration de facteurs solubles tels que les nutriments, les déchets et les composés de signalisation sécrétés (facteurs de croissance, cytokines). En outre, il comprend l’organisation de la matrice extracellulaire (ECM), les interactions cellulaires et la signalisation intercellulaire, et d’autres aspects de l’architecture tridimensionnelle particulière (3D) de la tumeur3,4, 5,6. Les conditions microenvironnementales spécifiques dans lesquelles les cellules cancéreuses existent, affectent profondément leur profil d’expression génique et leurs propriétés fonctionnelles, et il est clair que, par rapport à celle des cellules cultivées en 2D, le phénotype des sphéroïdes 3D imite beaucoup plus étroitement celui des tumeurs in vivo7,8,9,10,11. Les modèles 2D, même s’ils emploient l’hypoxie, le pH acide, et les concentrations élevées de lactate pour imiter des aspects connus du microenvironnement de tumeur, échouent toujours à capturer les gradients des paramètres physico-chimiques surgissant dans des tumeurs, aussi bien que leur tumeur 3D architecture. D’autre part, les modèles animaux sont coûteux, lents, et éthiquement problématiques, et généralement, ont également des lacunes dans leur capacité à récapituler les conditions tumorales humaines. Par conséquent, les sphéroïdes 3D ont été appliqués comme un modèle de complexité intermédiaire dans les études d’un large éventail de propriétés de la plupart des cancers solides9,11,12,13, 14,15,16,17.
Une utilisation largement employée des sphéroïdes 3D est dans les essais de criblage de l’efficacité de thérapie anticancéreuse9,18,19,20. Les réponses de traitement sont particulièrement sensibles au microenvironnement de tumeur, reflétant à la fois l’impact de la tortuosité, de la diffusion restreinte, de la pression interstitielle élevée, et du pH environnemental acide sur la livraison de drogue, et de l’impact de l’hypoxie et d’autres aspects du microenvironnement sur la réponse de mort cellulaire9,17. Parce que l’environnement au sein des sphéroïdes 3D développe intrinsèquement toutes ces propriétés7,8,9,10,11, en utilisant des cultures cellulaires 3D peut améliorer considérablement la traduction des résultats vers des conditions in vivo, tout en permettant un dépistage efficace et abordable de la croissance nette. Cependant, la grande majorité des études sur la réponse médicamenteuse des cellules cancéreuses sont toujours menées dans des conditions 2D. Ceci reflète probablement que, tandis que quelques essais peuvent relativement facilement être mis en œuvre pour des cultures de cellules 3D, beaucoup, tels que des essais de viabilité, le ballonnement occidental, et l’analyse d’immunofluorescence, sont beaucoup plus commodement faits en 2D qu’en 3D.
Le but du travail actuel est de fournir des essais facilement favorables et des protocoles précis pour des analyses de l’effet du traitement avec des médicaments anticancéreux sur la viabilité et la survie des cellules cancéreuses dans un cadre de tumor 3D imitant. Plus précisément, nous fournissons et comparons trois méthodes différentes pour la formation de sphéroïdes, suivies de méthodes d’analyses qualitatives et quantitatives de la croissance, de la viabilité et de la réponse aux médicaments.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’utilisation des sphéroïdes de cellules cancéreuses 3D s’est avérée un outil valable et polyvalent non seulement pour le criblage de drogue anticancéreux, mais également pour gagner la perspicacité mécaniste dans la régulation de la mort et de la viabilité de cellules cancéreuses dans des conditions imitant ceux dans la tumeur microenvironnement. Ceci est particulièrement crucial car l’accessibilité, l’utilisation cellulaire, et les effets intracellulaires des drogues chimiothérapeutiques sont profondéme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à Katrine Franklin Mark et Annette Bartels pour l’excellente assistance technique et à Asbjarn N’hr-Nielsen pour l’exécution des expériences dans figure 1D. Ce travail a été financé par la Fondation Einar Willumsen, la Fondation Novo Nordisk et la Fondation Juchum (tous à SFP).
Materials
| 2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
| 5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
| 5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
| Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
| Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
| Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
| Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
| Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
| Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
| BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
| Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
| Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
| Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
| Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
| FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
| Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
| Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
| ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
| Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
| Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
| MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
| NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
| Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
| Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
| Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
| Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
| Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
| Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
| Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |
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