הערכת הכדאיות תא ומוות ב 3D בתרבויות ספרואיד של תאים סרטניים

Summary

כאן, אנו מציגים מספר שיטות פשוטות להערכת הכדאיות והמוות ב-3D הסרטן תאים spheroids, אשר לחקות את פיזיקאלית-כימיים מעברי הצבע של גידולים vivo הרבה יותר טוב מאשר תרבות דו-ממדית. מודל ספרואיד, לכן, מאפשר הערכה של יעילות התרופה לסרטן עם תרגום משופר בתנאים vivo.

Abstract

Spheroids תלת מימדי של תאים סרטניים הם כלים חשובים עבור שני מסכי תרופה לסרטן, לקבלת תובנה מכניסטית לביולוגיה תא סרטן. הכוח של הכנה זה טמון ביכולתה לחקות היבטים רבים של התנאים vivo של גידולים תוך להיות מהיר, זול, תכליתי מספיק כדי לאפשר יחסית הקרנת תפוקה גבוהה. תנאי התרבות הספרואיד יכולים ללכוד את מעברי הצבע הפיזיקאלית-כימיים בגידול, כולל חומציות החילוץ ההולכת וגוברת, מוגברת לקטט, והפחתת הגלוקוז וזמינות החמצן, מהפריפריה הספרואיד עד ליבה. כמו כן, תכונות מכניות ואינטראקציות תא התא של גידולים vivo הם חלק מחקה על ידי מודל זה. המאפיינים הספציפיים וכתוצאה מכך את תנאי הצמיחה האופטימלי, של spheroids 3D, שונים באופן נרחב בין סוגים שונים של תאים סרטניים. יתר על כן, הערכת הכדאיות של תאים ומוות ב-spheroids 3D דורש שיטות שונות בחלק מאלה מועסקים עבור תרבויות דו-ממדיות. כאן אנו מתארים מספר פרוטוקולים להכנת spheroids תלת-ממד של תאים סרטניים, ועל שימוש בתרבויות כאלה כדי להעריך את הכדאיות התאים ואת המוות בהקשר של הערכת היעילות של תרופות נגד סרטן.

Introduction

השימוש במודלים ספרואידים בביולוגיה של סרטן הוא מספר עשורים בן^1,2, אבל צבר מומנטום משמעותי בשנים האחרונות. בחלק הגדול, זה משקף את המודעות הגוברת של כמה חזק הפנוטיפ של תאים סרטניים תלוי המיקרוסביבה שלהם ותנאי גדילה ספציפיים. המיקרואקולוגיה בגידולים מוצקים שונה ביסודה מזה ברקמות הנורמלי המקביל. זה כולל מצבים פיזיקאלית-כימיים כגון pH, מתח חמצן, כמו גם הלחץ ביניים, ריכוז מעברי הצבע של גורמים מסיסים כגון חומרים מזינים, פסולת מוצרים, מופרש תרכובות איתות (גורמי גדילה, ציטוקינים). יתרה מזאת, היא כוללת את הארגון של מטריצה החילוץ (ecm), אינטראקציות תא תא ו איתות התרבות, והיבטים אחרים של הארכיטקטורה תלת ממדית מסוימת (3d) של הגידול^{3,4, 5,6}. התנאים המיקרוסביבתיים הספציפיים שבהם תאים סרטניים קיימים, משפיעים עמוקות על פרופיל הביטוי הגנטי שלהם ועל תכונות הפונקציונליות שלהם, וברור כי בהשוואה לאלה של תאים שגדלו ב-2D, הפנוטיפ של הספרואידים תלת-ממדיים הרבה יותר מחקה מקרוב זה של בvivo גידולים^7,8,9,10,11. 2D מודלים, גם אם הם מעסיקים היפוקסיה, חומציות חומצי, וריכוזים גבוהים לקטט לחקות היבטים ידועים של מיקרוסביבה הגידול, עדיין להיכשל ללכוד את מעברי הצבע של הפרמטרים פיזיקאלית-כימיים הנובעים בתוך גידולים, כמו גם גידול תלת-ממד שלהם אדריכלות. מאידך, מודלים בעלי חיים יקרים, איטיים ובעייתיים באופן מבחינה מוסרית, ובדרך כלל גם יש חסרונות ביכולתם ללכוד את מצבם של הגידול האנושי. אפוא, 3d spheroids הוחלו כמודל מורכבות ביניים במחקרים של מגוון רחב של מאפיינים של סרטן מוצק ביותר^{9,11,12,13, 14,15,16,17}.

שימוש נרחב בשימוש בspheroids 3d הוא בהקרנה בחני של טיפול אנטי סרטן יעילות^9,18,19,20. תגובות הטיפול רגישות במיוחד מיקרוסביבה הגידול, המשקף הן את ההשפעה של tortuosity, דיפוזיה מוגבלת, לחץ ביניים גבוהה, ו-pH הסביבה חומצי על משלוח תרופות, ואת ההשפעה של היפוקסיה ועוד היבטים של המיקרו-סביבה על תגובת מוות בתא^9,17. בגלל הסביבה בתוך spheroids 3d מפתחת באופן מיסודו את כל המאפיינים הללו^7,8,9,10,11, העסקת תרבויות 3d תאים יכול ל לשפר באופן משמעותי את התרגום של תוצאות בתנאים vivo, ועם זאת לאפשר הקרנת תפוקה גבוהה יעילה ובמחיר סביר של הצמיחה נטו. עם זאת, הרוב הגדול של המחקרים על תגובת התרופה של תאים סרטניים עדיין מתבצעות תחת תנאים 2D. זה כנראה משקף כי, בעוד כמה בחני יכול בקלות להיות מיושם עבור תרבויות תא תלת-ממד, רבים, כגון הכדאיות, כתמים מערביים, וניתוח immunofluorescence, הם הרבה יותר נוח לעשות ב-2d מאשר 3d.

מטרת העבודה הנוכחית היא לספק בקלות הקלה מענה ופרוטוקולים מדויקים עבור ניתוחים של השפעת הטיפול עם תרופות נגד סרטן על הכדאיות של תאים סרטניים והישרדות בקביעת הגידול תלת ממדי מחקה. באופן ספציפי, אנו מספקים ולהשוות שלוש שיטות שונות עבור היווצרות כספרואיד, ואחריו שיטות לניתוח איכותי וכמותי של צמיחה, הכדאיות ותגובת התרופה.

Protocol

1. הדור של הספרואידים הכנת השעיות של תאים עבור היווצרות הספרואידהערה: לקווי תאים שונים יש מאפייני הדבקה שונים מאוד והפרוטוקול המתאים ביותר של היווצרות הספרואיד חייב להיות מבוסס בכל מקרה. מצאנו כי MCF-7 ו-BxPC-3 תאים מתאימים היווצרות ספרואיד ספונטנית, בעוד מד א-MB-231, SKBr-3, Panc-1 ו-MiaPaC…

Representative Results

הצמיחה ספרואיד המבוססת על פרוטוקול היווצרות ספרואיד מומחש באיור 1A ו איור 1B, שימשו נקודת התחלה לניתוח של ההשפעות של תרופות נגד סרטן בגידול תלת מימד הגדרה מחקה. הקלות שבה נוצרות הספרואידים היא קו התאים הספציפי, וקווי תאים מסוימים דורשים תו?…

Discussion

השימוש של הסרטן 3D spheroids הוכיחה כלי רב ערך רב-תכליתי לא רק לסינון תרופות נגד סרטן, אלא גם לקבלת תובנה מכניסטית לתוך הרגולציה של מוות תא סרטן הכדאיות בתנאים לחקות את אלה בגידול מיקרואקולוגיה. זה חיוני במיוחד כמו נגישות, ספיגת הסלולר, תופעות תאיים של תרופות כימותרפיות מושפעים עמוקות על ידי התנ…

Materials

2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI)	Invitrogen	# C10595	For staining nuclei
5-Fluorouracil (5-FU)	Sigma-Aldrich	#F6627	Component in chemotherapeutic treatment
5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA)	Life Technologies	#E3111	Inhibitor of NHE1
Antibody against PARP and cPARP	Cell signaling	#9542	Used in western blotting
Antibody against Ki-67	Cell signaling	#9449	Used for IHC
Antibody against p53	Cell Signaling	#2524	Used for IHC
Antibody against β-actin	Sigma	A5441	Used in western blotting
Bactoagar	BD Bioscience	#214010	Used for agarose gel preparation
Benchmark protein ladder	Invitrogen	#10747-012	Used for SDS-PAGE
Bio-Rad DC Protein Assay kit	Bio-Rad Laboratories	#500-0113, #500-0114, #500-0115	Used for protein determination from lysates
Bürker chamber	Marienfeld	610311	For cell counting
BX63 epifluoresence microscope	Olympus		Used for fluorescent imaging
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	#G9681	Used for the cell viability assay
Cisplatin	Sigma-Aldrich	#P4394	Component in chemotherapeutic treatment
Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom,  Ultra-low attachment, With lid, Sterile	Corning	#4520	Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point
Corning 96 well, clear round bottom,  Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile	Corning	#7007	Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point
Criterion TGX Precast Gels	Bio-Rad	5671025	Used for SDS-PAGE
Doxorubicin	Abcam	#120629	Component in chemotherapeutic treatment
FLUOStar Optima Microplate reader	BMG Labtech		Used for recording luminescence
Formaldehyde	VWR Chemicals	#9713.1000	Used for cell fixation
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Gibco	#A1413202	Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol.
Heat-inactivated FBS	Sigma	#F9665	Serum for growth media
ImageJ	NIH		Scientific Image analysis
Medim Uni-safe casette	Medim Histotechnologie	10-0114	Used for storage of embedded spheroids
Mini protease inhibitor cocktail tablets	Roche Diagnostics GmBH	# 11836153001	Used for lysis buffer preparation
MZ16 microscope	Leica		Used for light microscopic images
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer	Invitrogen	#NP0007	Used for western blotting
Pierce ECL Western blotting substrate	Thermo scientific	#32106	Used for western blotting
Ponceau S	Sigma-Aldrich	#P7170-1L	Used for protein band staining
Prism 6.0	Graphpad		Scientific graphing and statistical software
Propidium iodide (1mg/ml solution in water)	Invitrogen	P3566	Light sensitive
Sterile reservoirs, multichannel	SPL lifesciences	21002	Used for seeding cells for spheroid formation
Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide	Menzel-Gläser	#J3800AMNZ	Microscope glass slide used for embedding
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	#T5648	Used as chemotherapeutic treatment
Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes	Bio-Rad	#170-4159	Used for western blotting
Tris/Glycine/SDS running buffer	Bio-Rad	#161 0732	Used for SDS-PAGE
Trypsin-EDTA solution	Sigma	#T4174	Cell dissociation enzyme