Оценка жизнеспособности и смерти клеток в 3D сфероидных культурах раковых клеток
Summary
Здесь мы представляем несколько простых методов оценки жизнеспособности и смерти в 3D раковых клеточных сфероидах, которые имитируют физико-химические градиенты опухолей in vivo гораздо лучше, чем 2D-культура. Таким образом, сфероидная модель позволяет оценить эффективность препарата от рака с улучшенным переводом в условия in vivo.
Abstract
Трехмерные сфероиды раковых клеток являются важными инструментами как для рака наркотиков экраны и для получения механистического понимания биологии раковых клеток. Сила этого препарата заключается в его способности имитировать многие аспекты in vivo условия опухолей, будучи быстрым, дешевым и универсальным достаточно, чтобы позволить относительно высокой пропускной способности скрининга. Условия сфероидной культуры могут резюмировать физико-химические градиенты в опухоли, включая повышение внеклеточной кислотности, увеличение лактата и снижение доступности глюкозы и кислорода, от сфероидной периферии до ее ядра. Кроме того, механические свойства и клеточные взаимодействия опухолей in vivo частично передразнятся этой моделью. Специфические свойства и, следовательно, оптимальные условия роста 3D-сфероидов сильно различаются между различными типами раковых клеток. Кроме того, оценка жизнеспособности клеток и смерти в 3D сфероидах требует методов, которые частично отличаются от тех, которые используются для 2D культур. Здесь мы описываем несколько протоколов для подготовки 3D сфероидов раковых клеток, а также для использования таких культур для оценки жизнеспособности клеток и смерти в контексте оценки эффективности противораковых препаратов.
Introduction
Использование многоклеточных моделей сфероидов в биологии рака несколько десятилетий старых1,2, но получил значительный импульс в последние годы. В значительной степени это отражает повышение осведомленности о том, насколько сильно фенотип раковых клеток зависит от их микросреды и специфических условий роста. Микросреда при твердых опухолях принципиально отличается от той, что в соответствующих нормальных тканях. Это включает в себя физико-химические условия, такие как рН, кислородное напряжение, а также интерстициальное давление, градиенты концентрации растворимых факторов, таких как питательные вещества, отходы и секретированные сигнальные соединения (факторы роста, цитокины). Кроме того, она включает в себя организацию внеклеточной матрицы (ECM), клеточных взаимодействий и межклеточной сигнализации, а также другие аспекты конкретной трехмерной (3D) архитектуры опухоли3,4, 5,6. Специфические микроэкологические условия, в которых существуют раковые клетки, глубоко влияют на их профиль экспрессии генов и функциональные свойства, и ясно, что, по сравнению с клетками, выращенными в 2D, фенотип 3D сфероидов гораздо более точно имитирует что из in vivo опухолей7,8,9,10,11. 2D модели, даже если они используют гипоксию, кислый рН и высокие концентрации лактата, чтобы имитировать известные аспекты микроокружения опухоли, по-прежнему не в состоянии захватить градиенты физико-химических параметров, возникающих в опухолях, а также их 3D опухоли Архитектура. С другой стороны, модели животных являются дорогостоящими, медленными и этически проблематичными, и, как правило, также имеют недостатки в их способности переизгладить условия опухоли человека. Следовательно, 3D сфероиды были применены в качестве промежуточной модели сложности висследованиях широкого спектра свойств большинства твердых раковых заболеваний 9,11,12,13, 14,15,16,17.
Широко используется 3D сфероиды в скрининговых анализов противораковой терапии эффективность9,18,19,20. Реакции на лечение особенно чувствительны к микроокружению опухоли, отражая как влияние мучительности, ограниченное диффузии, высокое интерстициальное давление, и кислый рН окружающей среды на доставку лекарств, так и влияние гипоксии и других аспекты микроокружения на реакции смерти клетки9,17. Потому что окружающая среда в 3D сфероиды по своей сути развивает все эти свойства7,8,9,10,11, используя 3D-клеточные культуры могут существенно улучшить перевод результатов в условия in vivo, но позволит ьсядую эффективную и доступную высокую пропускную работу скрининга чистого роста. Тем не менее, подавляющее большинство исследований по лекарственной реакции раковых клеток по-прежнему проводятся в 2D условиях. Это, вероятно, отражает, что, в то время как некоторые анализы могут относительно легко быть реализованы для 3D-клеточных культур, многие, такие как анализы жизнеспособности, западные промотирование, и иммунофлуоресценции анализа, гораздо удобнее сделать в 2D, чем в 3D.
Цель юрисовской работы заключается в предоставлении легко поддающихся капсулам анализов и точных протоколов анализа влияния лечения противораковыми препаратами на жизнеспособность раковых клеток и выживание в 3D-опухоли, имитирующей обстановку. В частности, мы предоставляем и сравниваем три различных метода формирования сфероидов, за которыми следуют методы качественного и количественного анализа роста, жизнеспособности и реакции на лекарства.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование 3D раковых клеток сфероидов оказался ценным и универсальным инструментом не только для скрининга противораковых препаратов, но и для получения механистического понимания регуляции смерти раковых клеток и жизнеспособности в условиях, имитирующих тех, кто в опухоли Микро…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Катрин Франклин Марк и Аннет Бартельс за отличную техническую помощь и Асбьёрн Нёр-Нильсен за проведение экспериментов на рисунке 1D. Эта работа была профинансирована Фондом Эйнара Виллумсена, Фондом Ново Нордиска и Фондом Juchum (все в SFP).
Materials
| 2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
| 5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
| 5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
| Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
| Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
| Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
| Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
| Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
| Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
| BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
| Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
| Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
| Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
| Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
| FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
| Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
| Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
| ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
| Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
| Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
| MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
| NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
| Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
| Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
| Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
| Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
| Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
| Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
| Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |
References
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids. British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).
- Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).
- Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS Genetics. 4 (12), 1000293 (2008).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30 (3), 247-255 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Jacobi, N., et al. Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling. Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).
- Rodriguez-Enriquez, S., et al. Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids. Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).
- Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).
- Andersen, A. P., et al. Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment. Molecular Cancer. 15 (1), 45 (2016).
- Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).
- Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).
- Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation. International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).
- Feng, H., et al. Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).
- Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. Journal of Visual Experiments. (66), e4218 (2012).
- Friedrich, J., et al. A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Andersen, A. P., et al. The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms. International Journal of Cancer. , (2018).
- Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).
- Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. Cancer Research. 41 (5), 2008-2013 (1981).
- Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).
- Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. Tumor pH and its measurement. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).
- Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M. MRI of the tumor microenvironment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 16 (4), 430-450 (2002).
- Vukovic, V., Tannock, I. F. Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan. British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).
- Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J., Teicher, B. A. . Cancer Drug Resistance. , 21-42 (2006).
- Lotz, C., et al. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells. Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLoS One. 12 (7), 0182039 (2017).
- Bochet, L., et al. Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. Cancer Research. 73 (18), 5657-5668 (2013).
- Amann, A., et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour – endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports. 7 (1), 2963 (2017).
- LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device. Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).
- Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths. Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).
- Wallace, D. I., Guo, X. Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models. Frontiers in Oncology. 3, 51 (2013).
- Michel, T., et al. Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids. Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).
- Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
