癌細胞の3Dスフェロイド培養における細胞生存率と死の評価
Summary
ここでは、生体内腫瘍の物理化学勾配を2D培養よりもはるかに優れた3D癌細胞スフェロイドで生存率と死亡を評価するためのいくつかの簡単な方法を紹介する。したがって、スフェロイドモデルは、生体内条件への翻訳を改善した癌薬効の評価を可能にする。
Abstract
がん細胞の三次元スフェロイドは、がんの薬物スクリーンとがん細胞生物学に対する機械的な洞察を得るための重要なツールです。この調製の力は、比較的高スループットスクリーニングを可能にするのに十分な速く、安価で汎用性がある一方で、腫瘍の生体内状態の多くの側面を模倣する能力にあります。スフェロイド培養条件は、細胞外の酸性度の増加、乳酸の増加、グルコースおよび酸素の利用可能性の低下を含む腫瘍内の物理化学勾配を、スフェロイド周辺からその中心まで要約することができる。また、生体内腫瘍の機械的特性および細胞間相互作用は、このモデルによって部分的に模倣される。3Dスフェロイドの特定の特性と結果的に最適な増殖条件は、異なるタイプの癌細胞間で大きく異なります。さらに、3Dスフェロイドにおける細胞の生存率と死亡の評価には、2D培養に用いられるものとは部分的に異なる方法が必要です。ここでは、がん細胞の3Dスフェロイドを準備するためのいくつかのプロトコルを説明し、そのような培養物を使用して、抗癌剤の有効性を評価する文脈で細胞の生存率と死亡を評価する。
Introduction
がん生物学における多細胞スフェロイドモデルの使用は数十年前の1、2であるが、近年かなりの勢いを得た。大部分は、がん細胞の表現型が微小環境と特定の成長条件にどれだけ強く依存しているかの認識の増加を反映しています。固形腫瘍の微小環境は、対応する正常組織の微小環境とは根本的に異なる。これには、pH、酸素張力、間質圧、栄養素、廃棄物、分泌シグナル伝達化合物(成長因子、サイトカイン)などの可溶性因子の濃度勾配が含まれます。さらに、細胞外マトリックス(ECM)の組織、細胞間相互作用および細胞間シグナル伝達、および腫瘍3、4の特定の3次元(3D)アーキテクチャの他の態様を含む。 5,6.がん細胞が存在する特定の微小環境条件は、遺伝子発現プロファイルと機能性に大きく影響し、2Dで増殖した細胞の表現型と比較して、3Dスフェロイドの表現型がはるかに密接に模倣していることは明らかである。生体内腫瘍7、8、9、10、11のそれ。2Dモデルは、低酸素症、酸性pH、高乳酸濃度を用いて腫瘍微小環境の既知の側面を模倣しても、腫瘍内で生じる物理化学的パラメータの勾配や3D腫瘍を捕捉できない。アーキテクチャ。一方、動物モデルは高価で、遅く、倫理的に問題があり、一般的に、ヒト腫瘍の状態を要約する能力にも欠点があります。その結果、3Dスフェロイドは、ほとんどの固形癌9、11、12、13、および幅広い特性の研究において中間複雑性モデルとして適用されている。14,15,16,17.
3Dスフェロイドの広く採用されている使用は、抗癌治療の有効性9、18、19、20のスクリーニングアッセイにあります。治療応答は、薬物送達に対する拷問、制限拡散、高い間質圧、酸性環境pHの薬物送達への影響、低酸素症および他の影響の両方を反映して、腫瘍微小環境に特に敏感である。細胞死応答9,17に関する微小環境の態様。3Dスフェロイド内の環境は、これらの特性のすべてが本質的に発達するので、3D細胞培養物を採用し、結果を生体内条件に大幅に改善し、同時に、正味成長の効率的で手頃な価格のハイスループットスクリーニングを可能にします。しかし、癌細胞の薬物応答に関する研究の大半は、依然として2D条件下で行われている。これは、一部のアッセイが3D細胞培養に比較的容易に実装できる一方で、生存率アッセイ、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光分析などの多くが、3Dよりも2Dではるかに便利に行われていることを反映している可能性があります。
本研究の目的は、抗癌剤による治療が癌細胞の生存率および生存に及ぼす効果を3D腫瘍模倣設定で容易に分析するための容易なアッセイと正確なプロトコルを提供することである。具体的には、スフェロイド形成に関する3つの異なる方法を提供し、比較し、続いて成長、生存率、薬物応答の定性的および定量的分析の方法を提供し、比較する。
Protocol
1. スフェロイドの生成 スフェロイド形成のための細胞懸濁液の準備注:異なる細胞株は非常に異なる接着特性を有し、最も適切なスフェロイド形成プロトコルは、それぞれのケースで確立されなければならない。MCF-7およびBxPC-3細胞は自発的なスフェロイド形成に適していることが分かっていますが、MDA-MB-231、SKBr-3、Panc-1およびMiaPaCaは、スフェロイドを正常に形成する…
Representative Results
図1A及び図1Bに概略的に示したスフェロイド形成プロトコルに基づくスフェロイド成長アッセイは、3D腫瘍における抗癌剤治療の効果を分析するための出発点として用いた。模倣設定。スフェロイドが形成される容易さは細胞株特異的であり、一部の細胞株は一貫性のあるスフェロイド22を形成するためにr…
Discussion
3D癌細胞スフェロイドの使用は、抗癌剤スクリーニングのためだけでなく、腫瘍内のものを模倣する条件下で癌細胞死と生存率の調節に機械的な洞察を得るための貴重で汎用性の高いツールを証明しています。マイクロ環境。これは、化学療法薬のアクセシビリティ、細胞取り込み、および細胞内効果が、pH、酸素張力、拷問性、および物理的および物理的および腫瘍内の物理化学的状態によ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、優れた技術支援を受けたカトリーヌ・フランクリン・マークとアネット・バルテルスと、図1Dで実験を行ったアスビョーン・ノハル・ニールセンに感謝しています。この作品は、アイナー・ウィラムセン財団、ノボ・ノルディスク財団、フォンダシオン・ジュチュム(すべてSFP)によって資金提供されました。
Materials
| 2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
| 5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
| 5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
| Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
| Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
| Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
| Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
| Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
| Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
| BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
| Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
| Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
| Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
| Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
| FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
| Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
| Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
| ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
| Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
| Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
| MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
| NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
| Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
| Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
| Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
| Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
| Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
| Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
| Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |
References
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids. British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).
- Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).
- Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS Genetics. 4 (12), 1000293 (2008).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30 (3), 247-255 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Jacobi, N., et al. Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling. Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).
- Rodriguez-Enriquez, S., et al. Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids. Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).
- Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).
- Andersen, A. P., et al. Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment. Molecular Cancer. 15 (1), 45 (2016).
- Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).
- Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).
- Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation. International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).
- Feng, H., et al. Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).
- Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. Journal of Visual Experiments. (66), e4218 (2012).
- Friedrich, J., et al. A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Andersen, A. P., et al. The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms. International Journal of Cancer. , (2018).
- Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).
- Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. Cancer Research. 41 (5), 2008-2013 (1981).
- Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).
- Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. Tumor pH and its measurement. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).
- Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M. MRI of the tumor microenvironment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 16 (4), 430-450 (2002).
- Vukovic, V., Tannock, I. F. Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan. British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).
- Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J., Teicher, B. A. . Cancer Drug Resistance. , 21-42 (2006).
- Lotz, C., et al. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells. Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLoS One. 12 (7), 0182039 (2017).
- Bochet, L., et al. Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. Cancer Research. 73 (18), 5657-5668 (2013).
- Amann, A., et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour – endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports. 7 (1), 2963 (2017).
- LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device. Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).
- Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths. Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).
- Wallace, D. I., Guo, X. Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models. Frontiers in Oncology. 3, 51 (2013).
- Michel, T., et al. Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids. Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).
- Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
Cite This Article
Rolver, M. G., Elingaard-Larsen, L. O., Pedersen, S. F. Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells. J. Vis. Exp. (148), e59714, doi:10.3791/59714 (2019).