Vurdering Cell levedyktighet og død i 3D spheroid kulturer av kreftceller

Summary

Her presenterer vi flere enkle metoder for å evaluere levedyktighet og død i 3D kreftcelle spheroids, som etterligner fysikalsk-kjemiske graderinger av in vivo svulster mye bedre enn 2D kulturen. Den spheroid modellen tillater derfor evaluering av effekten av kreft stoffet med forbedret oversettelse til in vivo-forhold.

Abstract

Tredimensjonale spheroids av kreftceller er viktige verktøy for både kreft narkotika skjermer og for å få mekanistisk innsikt i kreftcelle biologi. Kraften i dette preparatet ligger i sin evne til å etterligne mange aspekter av in vivo forhold av svulster, samtidig som rask, billig og allsidig nok til å tillate relativt høy gjennomstrømming screening. Spheroid kultur forhold kan recapitulate fysikalsk-kjemiske graderinger i en svulst, inkludert den økende ekstracellulære Surhet, økt melkesyre, og redusere glukose og oksygen tilgjengelighet, fra spheroid periferi til kjernen. Også mekaniske egenskaper og celle-celle interaksjoner av in vivo svulster er delvis etterlignet av denne modellen. De spesifikke egenskaper og følgelig de optimale vekstforhold, av 3D spheroids, varierer mye mellom ulike typer kreftceller. Videre krever vurderingen av celle levedyktighet og død i 3D-spheroids metoder som avviker delvis fra de som er ansatt for 2D-kulturer. Her beskriver vi flere protokoller for å forberede 3D-spheroids av kreftceller, og for å bruke slike kulturer for å vurdere celle levedyktighet og død i sammenheng med å evaluere effekten av anticancer legemidler.

Introduction

Bruken av flercellede spheroid modeller i kreft biologi er flere ti år gammel^1,2, men har fått betydelig momentum de siste årene. I stor grad, dette reflekterer økt bevissthet om hvor sterkt fenotype av kreftceller er avhengig av deres mikromiljøet og spesifikke vekstforhold. Mikromiljøet i solide svulster er fundamentalt forskjellig fra det i tilsvarende normalt vev. Dette inkluderer fysikalsk forhold som pH, oksygen spenninger, samt interstitiell trykk, konsentrasjon graderinger av løselige faktorer som næringsstoffer, avfallsprodukter, og utskilles signalering forbindelser (vekstfaktorer, cytokiner). Videre omfatter det organiseringen av ekstracellulære Matrix (ECM), celle-celle interaksjoner og intercellulære signalering, og andre aspekter av den spesielle tredimensjonale (3D) arkitektur av tumor^{3,4, 5,6}. Den spesifikke microenvironmental forhold der kreftceller eksisterer, dypt påvirke deres genuttrykk profil og funksjonelle egenskaper, og det er klart at, sammenlignet med celler dyrket i 2D, fenotype av 3D spheroids mye nærmere etterligner at av in vivo svulster^{7, 8,9,10,11}. 2D-modeller, selv om de ansetter hypoksi, syrlig pH, og høy melkesyre konsentrasjoner å etterligne kjente aspekter av tumor mikromiljøet, fortsatt ikke klarer å fange graderinger av fysikalsk-kjemiske parametre som oppstår innenfor svulster, så vel som deres 3D svulst Arkitektur. På den annen side, dyremodeller er kostbare, langsom, og etisk problematisk, og generelt, har også svakheter i sin evne til å recapitulate menneskelige tumor forhold. Følgelig har 3D spheroids blitt brukt som en mellomliggende kompleksitet modell i studier av et bredt spekter av egenskaper av de fleste solide kreft^{9,11,12,13, 14,15,16,17}.

En utbredt bruk av 3D spheroids er i screening analyser av anticancer terapi effekt^9,18,^19,20. Behandlings responsen er spesielt følsomme for tumor mikromiljøet, som reflekterer både virkningen av tortuosity, begrenset diffusjon, høyt interstitiell trykk, og sure miljømessige pH på narkotika levering, og virkningen av hypoksi og andre aspekter av mikromiljøet på cellen død respons^9,17. Fordi miljøet innen 3D spheroids iboende utvikler alledisse egenskapene^7,8,⁹,^10,11, ansette 3D cellekulturer kan vesentlig forbedre oversettelsen av resultatene til in vivo forhold, men likevel tillate effektiv og rimelig høy gjennomstrømming screening av netto vekst. Imidlertid er det store flertallet av studier på stoffet responsen av kreftceller fortsatt utført under 2D forhold. Dette gjenspeiler sannsynligvis, mens noen analyser relativt lett kan implementeres for 3D cellekulturer, mange, slik som levedyktighet analyser, vestlig blotting, og immunofluorescence analyse, er mye mer praktisk gjort i 2D enn i 3D.

Målet med dagens arbeid er å gi lett mottagelig analyser og presise protokoller for analyser av effekten av behandling med anti-kreft narkotika på kreftcelle levedyktighet og overlevelse i en 3D svulst etterligne innstillingen. Nærmere bestemt gir vi og sammenligner tre ulike metoder for spheroid dannelse, etterfulgt av metoder for kvalitative og kvantitative analyser av vekst, levedyktighet og narkotika respons.

Protocol

1. generering av Spheroids Klargjøre celle suspensjoner for spheroid dannelseMerk: ulike cellelinjer har svært forskjellige vedheft egenskaper og den mest egnede spheroid formasjon protokollen må etableres i hvert enkelt tilfelle. Vi har funnet at MCF-7 og BxPC-3-celler er egnet for spontan spheroid formasjon, mens MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 og MiaPaCa krever tilsetning av rekonstituert kjeller membran for å kunne danne spheroids. Bare MDA-MB-231 og BxPC-3-celler har vært ansatt for he…

Representative Results

Spheroid vekst analyser basert på den spheroid formasjon protokollen skjematisk illustrert i figur 1A og figur 1B, ble brukt som et utgangspunkt for analyse av virkningene av anti-kreft narkotika behandlinger i en 3D svulst innstilling. Den enkle som spheroids dannes er cellelinje spesifikke, og noen cellelinjer krever tilskudd med rBM for å danne sammenhengende spheroids22. Konsentrasjonen av rBM lagt …

Discussion

Bruken av 3D kreftcelle spheroids har vist en verdifull og allsidig verktøy ikke bare for anticancer narkotika screening, men også for å få mekanistisk innsikt i regulering av kreftcelledød og levedyktighet under forhold etterligne de i svulsten mikromiljøet. Dette er spesielt viktig ettersom tilgjengeligheten, mobil opptaket og intracellulære effekter av kjemoterapeutiske legemidler er dypt påvirket av de fysikalsk-kjemiske forholdene i svulsten, inkludert pH, oksygen spenninger, tortuosity og fysiske og kjemisk…

Materials

2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI)	Invitrogen	# C10595	For staining nuclei
5-Fluorouracil (5-FU)	Sigma-Aldrich	#F6627	Component in chemotherapeutic treatment
5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA)	Life Technologies	#E3111	Inhibitor of NHE1
Antibody against PARP and cPARP	Cell signaling	#9542	Used in western blotting
Antibody against Ki-67	Cell signaling	#9449	Used for IHC
Antibody against p53	Cell Signaling	#2524	Used for IHC
Antibody against β-actin	Sigma	A5441	Used in western blotting
Bactoagar	BD Bioscience	#214010	Used for agarose gel preparation
Benchmark protein ladder	Invitrogen	#10747-012	Used for SDS-PAGE
Bio-Rad DC Protein Assay kit	Bio-Rad Laboratories	#500-0113, #500-0114, #500-0115	Used for protein determination from lysates
Bürker chamber	Marienfeld	610311	For cell counting
BX63 epifluoresence microscope	Olympus		Used for fluorescent imaging
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	#G9681	Used for the cell viability assay
Cisplatin	Sigma-Aldrich	#P4394	Component in chemotherapeutic treatment
Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom,  Ultra-low attachment, With lid, Sterile	Corning	#4520	Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point
Corning 96 well, clear round bottom,  Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile	Corning	#7007	Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point
Criterion TGX Precast Gels	Bio-Rad	5671025	Used for SDS-PAGE
Doxorubicin	Abcam	#120629	Component in chemotherapeutic treatment
FLUOStar Optima Microplate reader	BMG Labtech		Used for recording luminescence
Formaldehyde	VWR Chemicals	#9713.1000	Used for cell fixation
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Gibco	#A1413202	Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol.
Heat-inactivated FBS	Sigma	#F9665	Serum for growth media
ImageJ	NIH		Scientific Image analysis
Medim Uni-safe casette	Medim Histotechnologie	10-0114	Used for storage of embedded spheroids
Mini protease inhibitor cocktail tablets	Roche Diagnostics GmBH	# 11836153001	Used for lysis buffer preparation
MZ16 microscope	Leica		Used for light microscopic images
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer	Invitrogen	#NP0007	Used for western blotting
Pierce ECL Western blotting substrate	Thermo scientific	#32106	Used for western blotting
Ponceau S	Sigma-Aldrich	#P7170-1L	Used for protein band staining
Prism 6.0	Graphpad		Scientific graphing and statistical software
Propidium iodide (1mg/ml solution in water)	Invitrogen	P3566	Light sensitive
Sterile reservoirs, multichannel	SPL lifesciences	21002	Used for seeding cells for spheroid formation
Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide	Menzel-Gläser	#J3800AMNZ	Microscope glass slide used for embedding
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	#T5648	Used as chemotherapeutic treatment
Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes	Bio-Rad	#170-4159	Used for western blotting
Tris/Glycine/SDS running buffer	Bio-Rad	#161 0732	Used for SDS-PAGE
Trypsin-EDTA solution	Sigma	#T4174	Cell dissociation enzyme