Summary

Beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen en de dood in 3D sferoïde culturen van kankercellen

Published: June 16, 2019
doi:

Summary

Hier presenteren we een aantal eenvoudige methoden voor de evaluatie van de levensvatbaarheid en de dood in 3D kanker cel sferoïden, die de fysisch-chemische gradiënten van in vivo tumoren veel beter dan de 2D-cultuur na te bootsen. Het sferoïde model maakt het dus mogelijk om de effectiviteit van kanker medicijnen te evalueren met een verbeterde vertaling naar in vivo omstandigheden.

Abstract

Driedimensionale sferoïden van kankercellen zijn belangrijke hulpmiddelen voor beide kanker geneesmiddelen schermen en voor het verkrijgen van mechanistische inzicht in kanker celbiologie. De kracht van deze voorbereiding ligt in zijn vermogen om te imiteren vele aspecten van de in vivo voorwaarden van tumoren terwijl ze snel, goedkoop, en veelzijdig genoeg om relatief high-throughput screening mogelijk te maken. De sferoïde cultuuromstandigheden kunnen recapituleren de fysisch-chemische gradiënten in een tumor, met inbegrip van de toenemende extracellulaire zuurgraad, verhoogde lactaat, en het verminderen van glucose en zuurstof beschikbaarheid, van de sferoïde periferie aan zijn kern. Ook de mechanische eigenschappen en cel-cel interacties van in vivo tumoren zijn deels nagebootst door dit model. De specifieke eigenschappen en bijgevolg de optimale groeiomstandigheden, van 3D sferoïden, verschillen sterk tussen verschillende soorten kankercellen. Voorts vereist de beoordeling van de levensvatbaarheid van de cellen en de dood in 3D sferoïden methodes die gedeeltelijk van die voor 2D culturen verschillen. Hier beschrijven we verschillende protocollen voor de voorbereiding van 3D sferoïden van kankercellen, en voor het gebruik van dergelijke culturen om de levensvatbaarheid van cellen en de dood te beoordelen in het kader van de evaluatie van de effectiviteit van antikanker

Introduction

Het gebruik van multicellulaire sferoïde modellen in de Kankerbiologie is een aantal decennia oud1,2, maar heeft aanzienlijke dynamiek opgedaan in de afgelopen jaren. Voor een groot deel weerspiegelt dit meer besef hoe sterk het fenotype van kankercellen afhankelijk is van hun micromilieu en specifieke groeiomstandigheden. De micromilieu in vaste tumoren is fundamenteel verschillend van dat in overeenkomstige normale weefsels. Dit omvat fysisch-chemische voorwaarden zoals pH, zuurstof spanning, evenals interstitiële druk, concentratie gradiënten van oplosbare factoren zoals voedingsmiddelen, afvalproducten, en afgescheiden signalerende samenstellingen (groeifactoren, cytokines). Bovendien omvat het de organisatie van de extracellulaire matrix (ECM), cel-cel interacties en intercellulaire signalering, en andere aspecten van de bijzondere drie-dimensionale (3D) architectuur van de tumor3,4, 5,6. De specifieke microecologische omstandigheden waarin kankercellen bestaan, hebben een diepgaande invloed op hun genexpressie profiel en functionele eigenschappen, en het is duidelijk dat, vergeleken met die van cellen gekweekt in 2D, het fenotype van 3D sferoïden veel nauwer nabootst die van in vivo tumoren7, 8,9,10,11. 2D-modellen, zelfs als ze in dienst hypoxie, zure pH, en hoge lactaat concentraties om na te bootsen bekende aspecten van de tumor micromilieu, nog steeds niet aan de gradiënten van de fysisch-chemische parameters die ontstaan binnen tumoren, evenals hun 3D-tumor vast te leggen Architectuur. Aan de andere kant, dierlijke modellen zijn kostbaar, traag en ethisch problematisch, en in het algemeen, hebben ook tekortkomingen in hun vermogen om de menselijke tumor voorwaarden recapituleren. Bijgevolg zijn 3D sferoïden toegepast als een intermediair complexiteits model in studies van een breed scala van eigenschappen van de meeste vaste kankers9,11,12,13, 14,15,16,17.

Een veelgebruikt gebruik van 3D sferoïden is in screening assays van kankertherapie werkzaamheid9,18,19,20. De reacties van de behandeling zijn bijzonder gevoelig voor de tumor microenvironment, die zowel de invloed van de tortuosity, de beperkte verspreiding, de hoge interstitiële druk, als zure milieu pH op druglevering weerspiegelt, en de invloed van hypoxie en andere aspecten van het micromilieu op de reactie van de celdood9,17. Omdat het milieu binnen 3D sferoïden inherent al deze eigenschappen7,8,9,10,11ontwikkelt, kan het tewerkstellen van 3D cel culturen aanzienlijk verbeteren van de vertaling van de resultaten in vivo omstandigheden, maar toch een efficiënte en betaalbare high-throughput screening van de netto-groei mogelijk te maken. Echter, de grote meerderheid van de studies over de drug Response van kankercellen worden nog steeds uitgevoerd onder 2D-omstandigheden. Dit waarschijnlijk weerspiegelt dat, terwijl sommige analyses kunnen relatief gemakkelijk worden geïmplementeerd voor 3D-cel culturen, veel, zoals levensvatbaarheid assays, West-bevlekken, en immunofluorescentie analyse, zijn veel handiger gedaan in 2D dan in 3D.

Het doel van het huidige werk is het verstrekken van gemakkelijk vatbaar analyses en precieze protocollen voor analyses van het effect van de behandeling met anti-kanker medicijnen op kankercellen levensvatbaarheid en overleving in een 3D-tumor nabootsen instelling. Concreet, bieden en vergelijken we drie verschillende methoden voor sferoïde vorming, gevolgd door methoden voor kwalitatieve en kwantitatieve analyses van groei, levensvatbaarheid en drug Response.

Protocol

1. generatie van Sferoïden Het voorbereiden van cel opschortingen voor sferoïde vormingNota: de verschillende cel lijnen hebben zeer verschillende adhesie eigenschappen en het geschiktste sferoïde vorming protocol moet in elk geval worden gevestigd. Wij hebben geconstateerd dat MCF-7 en BxPC-3 cellen voor spontane sferoïde vorming geschikt zijn, terwijl MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 en MiaPaCa de toevoeging van opnieuw samengesteld kelder membraan vereisen om met succes sferoïden te vorme…

Representative Results

Sferoïde groei analyses gebaseerd op het sferoïde formatie protocol schematisch geïllustreerd in Figuur 1A en Figuur 1B, werden gebruikt als uitgangspunt voor de analyse van de effecten van anti-kankerbehandelingen in een 3D tumor nabootsen instelling. Het gemak waarmee sferoïden worden gevormd is specifieke cel lijn, en sommige cel lijnen vereisen aanvulling met rBM om coherente sferoïden22te vormen…

Discussion

Het gebruik van 3D kanker cel sferoïden heeft bewezen een waardevol en veelzijdig instrument niet alleen voor antikanker drug screening, maar ook voor het verkrijgen van mechanistische inzicht in de regulering van kankercellen dood en levensvatbaarheid onder omstandigheden nabootsen die in de tumor micro-omgeving. Dit is vooral van cruciaal belang als de toegankelijkheid, cellulaire opname, en intracellulaire effecten van chemotherapeutische drugs zijn diep beïnvloed door de fysisch-chemische omstandigheden in de tumor…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zijn dankbaar voor Katrine Franklin Mark en Annette Bartels voor uitstekende technische hulp en om Asbjørn Nøhr-Nielsen voor het uitvoeren van de experimenten in figuur 1D. Dit werk werd gefinancierd door de Stichting Willumsen, de Novo Nordisk Foundation, en de Fondation juchum (all to SFP).

Materials

2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) Invitrogen # C10595  For staining nuclei
5-Fluorouracil (5-FU) Sigma-Aldrich #F6627 Component in chemotherapeutic treatment
5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) Life Technologies #E3111 Inhibitor of NHE1
Antibody against PARP and cPARP Cell signaling #9542 Used in western blotting
Antibody against Ki-67 Cell signaling #9449 Used for IHC
Antibody against p53 Cell Signaling  #2524  Used for IHC
Antibody against β-actin Sigma  A5441 Used in western blotting
Bactoagar BD Bioscience #214010 Used for agarose gel preparation
Benchmark protein ladder Invitrogen #10747-012 Used for SDS-PAGE
Bio-Rad DC Protein Assay kit Bio-Rad Laboratories #500-0113, #500-0114, #500-0115   Used for protein determination from lysates
Bürker chamber Marienfeld 610311 For cell counting 
BX63 epifluoresence microscope Olympus Used for fluorescent imaging
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega #G9681 Used for the cell viability assay
Cisplatin Sigma-Aldrich #P4394  Component in chemotherapeutic treatment
Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom,  Ultra-low attachment, With lid, Sterile Corning #4520 Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point
Corning 96 well, clear round bottom,  Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile Corning #7007 Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point
Criterion TGX Precast Gels Bio-Rad 5671025 Used for SDS-PAGE
Doxorubicin Abcam #120629 Component in chemotherapeutic treatment
FLUOStar Optima Microplate reader BMG Labtech Used for recording luminescence 
Formaldehyde  VWR Chemicals  #9713.1000  Used for cell fixation
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Gibco #A1413202 Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol.
Heat-inactivated FBS Sigma #F9665 Serum for growth media
ImageJ NIH Scientific Image analysis
Medim Uni-safe casette Medim Histotechnologie 10-0114 Used for storage of embedded spheroids
Mini protease inhibitor cocktail tablets Roche Diagnostics GmBH  # 11836153001 Used for lysis buffer preparation
MZ16 microscope Leica Used for light microscopic images
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer  Invitrogen #NP0007 Used for western blotting
Pierce ECL Western blotting substrate Thermo scientific #32106 Used for western blotting
Ponceau S Sigma-Aldrich #P7170-1L Used for protein band staining
Prism 6.0 Graphpad Scientific graphing and statistical software
Propidium iodide (1mg/ml solution in water) Invitrogen  P3566 Light sensitive 
Sterile reservoirs, multichannel SPL lifesciences 21002 Used for seeding cells for spheroid formation
Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide  Menzel-Gläser #J3800AMNZ Microscope glass slide used for embedding
Tamoxifen Sigma-Aldrich #T5648 Used as chemotherapeutic treatment
Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes Bio-Rad #170-4159 Used for western blotting
Tris/Glycine/SDS running buffer  Bio-Rad  #161 0732 Used for SDS-PAGE
Trypsin-EDTA solution Sigma #T4174  Cell dissociation enzyme

References

  1. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  2. Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids. British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).
  3. Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).
  4. Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS Genetics. 4 (12), 1000293 (2008).
  5. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  6. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30 (3), 247-255 (2003).
  7. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  8. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  9. Jacobi, N., et al. Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling. Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).
  10. Rodriguez-Enriquez, S., et al. Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids. Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).
  11. Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).
  12. Andersen, A. P., et al. Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment. Molecular Cancer. 15 (1), 45 (2016).
  13. Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).
  14. Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).
  15. Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation. International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).
  16. Feng, H., et al. Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).
  17. Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).
  18. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
  19. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  20. Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. Journal of Visual Experiments. (66), e4218 (2012).
  21. Friedrich, J., et al. A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).
  22. Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).
  23. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
  24. Andersen, A. P., et al. The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms. International Journal of Cancer. , (2018).
  25. Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).
  26. Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. Cancer Research. 41 (5), 2008-2013 (1981).
  27. Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).
  28. Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. Tumor pH and its measurement. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).
  29. Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M. MRI of the tumor microenvironment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 16 (4), 430-450 (2002).
  30. Vukovic, V., Tannock, I. F. Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan. British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).
  31. Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J., Teicher, B. A. . Cancer Drug Resistance. , 21-42 (2006).
  32. Lotz, C., et al. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells. Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).
  33. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
  34. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
  35. Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLoS One. 12 (7), 0182039 (2017).
  36. Bochet, L., et al. Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. Cancer Research. 73 (18), 5657-5668 (2013).
  37. Amann, A., et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour – endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports. 7 (1), 2963 (2017).
  38. LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device. Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).
  39. Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths. Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).
  40. Wallace, D. I., Guo, X. Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models. Frontiers in Oncology. 3, 51 (2013).
  41. Michel, T., et al. Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids. Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).
  42. Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
check_url/59714?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Rolver, M. G., Elingaard-Larsen, L. O., Pedersen, S. F. Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells. J. Vis. Exp. (148), e59714, doi:10.3791/59714 (2019).

View Video