Valutare la vitalità cellulare e la morte nelle colture di sferoidi 3D delle cellule tumorali
Summary
Qui, presentiamo diversi semplici metodi per valutare la vitalità e la morte negli sferoidi delle cellule tumorali 3D, che imitano i gradienti fisico-chimici dei tumori in vivo molto meglio della cultura 2D. Il modello sferoide, quindi, consente di valutare l’efficacia del farmaco controilcancro con una migliore traduzione in condizioni in vivo.
Abstract
Gli sferoidi tridimensionali delle cellule tumorali sono strumenti importanti sia per gli schermi di farmaci per il cancro che per ottenere informazioni meccanicistiche sulla biologia delle cellule tumorali. Il potere di questa preparazione sta nella sua capacità di imitare molti aspetti delle condizioni in vivo dei tumori pur essendo veloce, economico e versatile abbastanza per consentire uno screening relativamente ad alto throughput. Le condizioni di coltura degli sferoidi possono ricapitolare i gradienti fisio-chimici in un tumore, tra cui la crescente acidità extracellulare, l’aumento della lattato e la diminuzione della disponibilità di glucosio e ossigeno, dalla periferia sferoide al suo nucleo. Inoltre, le proprietà meccaniche e le interazioni cellula-cellula dei tumori in vivo sono in parte imitate da questo modello. Le proprietà specifiche e di conseguenza le condizioni ottimali di crescita, degli sferoidi 3D, differiscono ampiamente tra i diversi tipi di cellule tumorali. Inoltre, la valutazione della vitalità cellulare e della morte negli sferoidi 3D richiede metodi che differiscono in parte da quelli impiegati per le colture 2D. Qui descriviamo diversi protocolli per la preparazione di sferoidi 3D delle cellule tumorali e per l’uso di tali colture per valutare la vitalità e la morte delle cellule nel contesto della valutazione dell’efficacia dei farmaci anticancro.
Introduction
L’uso di modelli di sferoide multicellulari nella biologia del cancro è di diversi decenni1,2, ma ha guadagnato uno slancio sostanziale negli ultimi anni. In gran parte, ciò riflette una maggiore consapevolezza di quanto fortemente il fenotipo delle cellule tumorali dipenda dal loro microambiente e dalle condizioni di crescita specifiche. Il microambiente nei tumori solidi è fondamentalmente diverso da quello nei tessuti normali corrispondenti. Questo include condizioni fisico-chimiche come pH, tensione di ossigeno, così come la pressione interstiziale, gradienti di concentrazione di fattori solubili come sostanze nutritive, prodotti di scarto, e composti di segnalazione secreted (fattori di crescita, citochine). Inoltre, include l’organizzazione della matrice extracellulare (ECM), le interazioni cellula-cellula e la segnalazione intercellulare, e altri aspetti della particolare architettura tridimensionale (3D) del tumore3,4, 5,6. Le condizioni specifiche dei microambientali in cui esistono le cellule tumorali, influenzano profondamente il loro profilo di espressione genica e le proprietà funzionali, ed è chiaro che, rispetto a quello delle cellule coltivate in 2D, il fenotipo degli sferoidi 3D imita molto più da vicino quella dei tumori in vivo7,8,9,10,11. I modelli 2D, anche se impiegano ipossia, pH acido e alte concentrazioni di lattati per imitare aspetti noti del microambiente tumorale, non riescono ancora a catturare i gradienti dei parametri fisico-chimici che sorgono all’interno dei tumori, così come il loro tumore 3D architettura. D’altra parte, i modelli animali sono costosi, lenti ed eticamente problematici, e in generale hanno anche carenze nella loro capacità di ricapitolare le condizioni del tumore umano. Di conseguenza, gli sferoidi 3D sono stati applicati come modello di complessità intermedia negli studi di una vasta gamma di proprietà della maggior parte dei tumori solidi9,11,12,13, 14,15,16,17.
Un uso ampiamente impiegato di sferoidi 3D è nello screening dei saggi di efficacia della terapia anticancro9,18,19,20. Le risposte al trattamento sono particolarmente sensibili al microambiente tumorale, riflettendo sia l’impatto della tortuosità, la diffusione limitata, l’alta pressione interstiziale e il pH ambientale acido sulla somministrazione di farmaci, sia l’impatto dell’ipossia e di altri aspetti del microambiente sulla risposta alla morte cellulare9,17. Poiché l’ambiente all’interno di sferoidi 3D sviluppa intrinsecamente tutte queste proprietà7,8,9,10,11, impiegando colture di cellule 3D può migliorare sostanzialmente la traduzione dei risultati in condizioni in vivo, pur consentire uno screening efficiente e conveniente ad alto consumo della crescita netta. Tuttavia, la grande maggioranza degli studi sulla risposta farmacologica delle cellule tumorali sono ancora effettuati in condizioni 2D. Questo probabilmente riflette che, mentre alcuni saggi possono essere implementati relativamente facilmente per le colture cellulari 3D, molti, come i saggi di fattibilità, il gonfiore occidentale e l’analisi dell’immunofluorescenza, sono fatti molto più convenientemente in 2D che in 3D.
L’obiettivo del presente lavoro è quello di fornire saggi facilmente disponibili e protocolli precisi per l’analisi dell’effetto del trattamento con farmaci anticancro sulla vitalità e la sopravvivenza delle cellule tumorali in un ambiente di imitazione del tumore 3D. In particolare, forniamo e confrontiamo tre diversi metodi per la formazione di sferoidi, seguiti da metodi per analisi qualitative e quantitative di crescita, vitalità e risposta ai farmaci.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’uso di sferoidi delle cellule tumorali 3D si è dimostrato uno strumento prezioso e versatile non solo per lo screening farmacologico anticancro, ma anche per ottenere informazioni meccanicistiche sulla regolazione della morte e della vitalità delle cellule tumorali in condizioni che imitano quelle nel tumore Microambiente. Ciò è particolarmente importante in quanto l’accessibilità, l’assorbimento cellulare e gli effetti intracellulari dei farmaci chemioterapici sono profondamente influenzati dalle condizioni fisic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Katrine Franklin Mark e Annette Bartels per l’eccellente assistenza tecnica e ad Asbjàrn N’hr-Nielsen per l’esecuzione degli esperimenti in Figura 1D. Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Einar Willumsen, dalla Novo Nordisk Foundation e dalla Fondation Juchum (tutti a SFP).
Materials
| 2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
| 5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
| 5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
| Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
| Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
| Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
| Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
| Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
| Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
| BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
| Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
| Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
| Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
| Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
| FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
| Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
| Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
| ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
| Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
| Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
| MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
| NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
| Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
| Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
| Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
| Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
| Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
| Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
| Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |
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