JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

جراحة استئصال النخاع الشوكي للحبل الشوكي وتقييم المحرك الحركي المفتوح في الفئران

Published: June 26, 2019
doi:
10.3791/59738
,
1Department of Neurosciences, Faculté de Médecine,Université de Montréal, 2Hôpital du Sacré-Cœur de Montréal, 3Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central (GRSNC),Université de Montréal

Summary

استئصال النخاع الشوكي الصدري الفئران هو نموذج قيّم واستنساخي لإصابة الحبل الشوكي من جانب واحد للتحقيق في الآليات العصبية للشفاء الحركي وفعالية العلاج. تتضمن هذه المقالة دليل مفصل خطوة بخطوة لتنفيذ إجراء استئصال الفص وتقييم الأداء الحركي في ساحة مفتوحة.

Abstract

تسبب إصابة الحبل الشوكي (SCI) اضطرابات في الوظائف الحركية والحسية واللاإرادية دون مستوى الآفة. النماذج الحيوانية التجريبية هي أدوات قيمة لفهم الآليات العصبية المشاركة في الانتعاش الحركي بعد SCI وتصميم العلاجات للسكان السريرية. هناك العديد من نماذج SCI التجريبية بما في ذلك الكدمة، والضغط، وإصابات المقطع التي تستخدم في مجموعة واسعة من الأنواع. ينطوي تشريح الاستئصال على تشريح أحادي الجانب للحبل الشوكي ويعطل جميع المسالك الصاعدة والتنازلية على جانب واحد فقط. ينتج استئصال النخاع الشوكي إصابة انتقائية للغاية وقابلة للاستنساخ بالمقارنة مع تقنيات الكدمة أو الضغط التي هي مفيدة للتحقيق في اللدونة العصبية في المسارات المنفلتة والتالفة المرتبطة بالانتعاش الوظيفي. نقدم بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لإجراء استئصال الأنسجة الصدريعلى مستوى الفقرات T8 في الفئران الذي يؤدي إلى شلل أولي للأطراف الخلفية على جانب الآفة مع الانتعاش التلقائي متدرج من وظيفة الحركية على مدى عدة اسابيع. كما نقدم بروتوكول تسجيل نقاط الحركية لتقييم الانتعاش الوظيفي في المجال المفتوح. يوفر التقييم الحركي ملف ًا تعريفًا خطيًا للتعافي ويمكن إجراؤه في وقت مبكر ومتكرر بعد الإصابة من أجل فحص الحيوانات بدقة للحصول على نقاط زمنية مناسبة لإجراء اختبارات سلوكية أكثر تخصصًا. ويمكن تكييف تقنية تشريح الاستئصال المقدمة بسهولة مع نماذج وأنواع أخرى من الاستئصال، ويمكن استخدام التقييم الحركي في مجموعة متنوعة من SCI ونماذج الإصابة الأخرى لتسجيل وظيفة المحرك الحركي.

Introduction

ترتبط إصابة الحبل الشوكي (SCI) باضطرابات شديدة في الوظائف الحركية والحسية واللاإرادية. النماذج الحيوانية التجريبية من SCI هي أدوات قيمة لفهم الأحداث التشريحية والفسيولوجية التي تنطوي عليها علم الأمراض SCI، للتحقيق في الآليات العصبية في الإصلاح والتعافي، وللفحص لفعالية وسلامة العلاجية المحتملة التدخلات. الفئران هي الأنواع الأكثر استخداما في البحوث SCI1. نماذج الفئران منخفضة التكلفة، وسهلة التكاثر، وبطارية كبيرة من الاختبارات السلوكية متاحة لتقييم النتائج الوظيفية2. على الرغم من بعض الاختلافات في مواقع المسالك، والحبل الشوكي الفئران يشارك وظائف الحسية مماثلة عموما مع الثدييات أكبر، بما في ذلك الرئيسيات3،4. الفئران أيضا حصة العواقب الفسيولوجية والسلوكية مماثلة لSCI التي تتعلق البشر5. يمكن أن توفر الرئيسيات غير البشرية والنماذج الحيوانية الكبيرة تقريبًا تقريبًا تقريبًا من SCI6 البشري وهي ضرورية لإثبات سلامة العلاج وفعاليته قبل التجارب البشرية، ولكنها أقل شيوعًا بسبب الرعاية الأخلاقية والحيوانية الاعتبارات والنفقات والمتطلبات التنظيمية7.

يتم تنفيذ نماذج SCI تشريح الفئران عن طريق انقطاع المستهدفة من الحبل الشوكي مع آفة انتقائية باستخدام سكين تشريح أو مقص استئصال القزحية بعد استئصال الصفيحة. بالمقارنة مع تشريح كامل، تشريح جزئي في الفئران يؤدي إلى إصابة أقل شدة، أسهل الرعاية الحيوانية بعد العملية الجراحية، والانتعاش الحركي التلقائي، وأكثر عن كثب نماذج SCI في البشر التي هي في الغالب غير مكتملة مع تجنيب جزئي من الأنسجة التي تربط الحبل الشوكيوالهياكل فوق الشوكي8 . ويعطل تشريح الفص اللاإحادي جميع المساحات الصاعدة والمنحدرة على جانب واحد فقط، وينتج عن عجز في المحركات يمكن قياسه كمياً وشديد الانحراف، مما يعزز استكشاف الآليات البيولوجية الأساسية. النتيجة الوظيفية الأبرز للاستئصال هو شلل الأطراف الأولي على نفس الجانب وتحت مستوى الآفة مع الانتعاش التلقائي متدرج من وظيفة الحركية على مدى عدة أسابيع9،10، 11 , 12.نموذج تشريح الاستئصال مفيد بشكل خاص للتحقيق في اللدونة العصبيةمن المسالك التالفة والمتبقية والدوائر المرتبطة الانتعاش الوظيفي 9،11،12، 13،14،15،16،17،18. على وجه التحديد، استئصال النخاع الذي يتم إجراؤه على مستوى الصدر، أي فوق الدوائر الشوكية التي تتحكم في الحركة الخلفية، مفيد بشكل خاص للتحقيق في التغيرات في التحكم الحركي. كما توجد علاقة غير خطية بين شدة الآفة والانتعاش الحركي بعد SCI19، والاختبار السلوكي المناسب لتقييم النتائج الوظيفية أمر بالغ الأهمية في النماذج التجريبية.

تتوفر بطارية شاملة من الاختبارات السلوكية لتقييم جوانب محددة من الاسترداد الحركي الوظيفي في الفئران2،20. العديد من الاختبارات الحركية لا توفر تدابير موثوق بها في وقت مبكر بعد SCI كما يتم تعطيل الفئران جداً لدعم وزن الجسم. مقياس الأداء الحركي التلقائي الذي هو حساس للعجز في وقت مبكر بعد الإصابة، ولا يتطلب التدريب قبل الجراحة أو المعدات المتخصصة، مفيد من أجل رصد الانتعاش الحركي للنقاط الزمنية المناسبة التي تكملة الاختبارات السلوكية المتخصصة. ومارتينيز في مجال مفتوح التقييم النتيجة10، وضعت أصلا لتقييم الأداء الحركي بعد SCI عنق الرحم في الفئران ، هو 20 نقطة درجة ordinal تقييم الأداء الحركي العالمي خلال الحركة فوق الأرض عفوية في حقل مفتوح. يتم إجراء التهديف بشكل منفصل لكل طرف باستخدام قاعدة تقيّم المعلمات المحددة لمجموعة من التدابير الحركية بما في ذلك حركة الأطراف المفصلية، ودعم الوزن، ووضع الأرقام، وقدرات الخطوات، وتنسيق الأطراف الخلفية، والذيل موقف. درجة التقييم مستمدة من مقياس تصنيف باسو وبيتي وبريسناهان (BBB) المفتوح المدى المصمم لتقييم الأداء الحركي بعد كدمة الصدر21. يتم تكييفها لتقييم دقيق وموثوق بها على حد سواء وظيفة اللوكوموتور، ويسمح لتقييم مستقل لمختلف المعلمات التهديف التي لا يمكن أن تكون قابلة للحصول على سجل هرمي من BBB، ويوفر الانتعاش الخطي الملف الشخصي10. بالإضافة إلى ذلك، بالمقارنة مع BBB، درجة التقييم حساسة وموثوق بها في نماذج الإصابات أكثر شدة10،11،20،22. وقد استخدمت درجة التقييم لتقييم ضعف الحركية في الفئران بعد عنق الرحم10،12 والصدر9 SCI وحدها وبالاشتراك مع إصابات الدماغ الصادمة23.

نقدم هنا بروتوكولاً مفصلاً خطوة بخطوة لإجراء عملية استئصال الأنسجة الصدرية SCI على مستوى الفقرات T8 في الفئران ذات الأطراف الطويلة، ولتقييم تعافي اللورومي الخلفي في الحقل المفتوح.

Protocol

أجريت التجارب الموصوفة في هذه المقالة وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي لرعاية الحيوان ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات في جامعة مونتريال. 1. جراحة استئصال الأنف الصدري ارتداء معدات واقية مناسبة (القفازات، قناع، وثوب) للحفاظ على بيئة مطهرة للجراحة. تنظيف المنطقة الجر?…

Representative Results

يمكن توليد الآفات القابلة للاستنساخ مع درجة عالية من الاتساق مع تقنية استئصال الأنسجة. لتقييم ومقارنة أحجام الآفات بين المجموعات التجريبية ، يمكن حساب المساحة القصوى للآفة كنسبة مئوية من إجمالي المقطع العرضي للحبل الشوكي بسهولة مع تلطيخ النسيج ية لأقسام الحبل الشوكي. ويبين ا?…

Discussion

قوة رئيسية لتقنية تشريح الاستئصال هي الانتقائية واستنساخ الآفة مما يؤدي إلى انخفاض التباين في الأنماط الظاهرية النسيجية والسلوكية بين الحيوانات25. من أجل ضمان آفة من جانب واحد على مستوى العمود الفقري المناسب، وتحديد دقيق لكل من الجزء الفقري السليم وخط الوسط الحبل الشوكي أمر …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل المعهد الكندي للبحوث الصحية؛ تم دعم MOP-142288) إلى M.M.M. بجائزة راتب من مؤسسة البحوث كيبيك سانتي (FRQS)، وكان A.R.B مدعوما ً بزمالة من FRQS.

Materials

Baytril CDMV 11242
Blunt dissection scissors World Precision Instruments 503669
Buprenorphine hydrochoride CDMV
Camera lens Pentax C31204TH 12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount
CMOS video camera Basler acA2000-165uc 2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3
Compressed oxygen gas Praxair
Cotton tipped applicators CDMV 108703
Delicate bone trimmers Fine Science Tools 16109-14
Dissecting knife Fine Science Tools 10055-12
Dumont fine forceps (#5) Fine Science Tools 11254-20
Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2  suture (J392H) CDMV 111689
Feedback-controlled heating pad Harvard Apparatus 55-7020
Female Long-Evans rats Charles River Laboratories Strain code: 006 225-250g
Gelfoam CDMV 102348
Curved hemostat forceps Fine Science Tools 13003-10
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Hydrogel 70-01-5022 Clear H20
Isofluorane CDMV 118740
Lactated Ringer's solution CDMV 116373
Lidocaine (2%) CDMV 123684
Needle 30 ga CDMV 4799
Open-field area Custom Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height
Opthalmic ointment CDMV 110704
Personal computer  With USB3 connectivity to record video with the listed camera
Physiological saline CDMV 1399
Proviodine CDMV 4568
Rodent Liquid Diet Bioserv F1268
Scalpal blade #11 CDMV 6671
Self-retaining retractor World Precision Instruments 14240
Vannas iridectomy spring scissors Fine Science Tools 15002-08
Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer Dispomed 975-0510-000
VLC media player VideoLAN videolan.org/vlc
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharif-Alhoseini, M., et al. Animal models of spinal cord injury: a systematic review. Spinal Cord. 55 (8), 714-721 (2017).
  2. Sedy, J., Urdzikova, L., Jendelova, P., Sykova, E. Methods for behavioral testing of spinal cord injured rats. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 32 (3), 550-580 (2008).
  3. Butler, A. B., Hodos, W. . Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , 139-152 (2005).
  4. Nudo, R. J., Masterton, R. B. Descending pathways to the spinal cord: a comparative study of 22 mammals. Journal of Comparative Neurology. 277 (1), 53-79 (1988).
  5. Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
  6. Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), 302ra134 (2015).
  7. Talac, R., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25 (9), 1505-1510 (2004).
  8. Kwon, B. K., Oxland, T. R., Tetzlaff, W. Animal models used in spinal cord regeneration research. Spine. 27 (14), 1504-1510 (2002).
  9. Brown, A. R., Martinez, M. Ipsilesional motor cortex plasticity participates in spontaneous hindlimb recovery after lateral hemisection of the thoracic spinal cord in the rat. Journal of Neuroscience. 38 (46), 9977-9988 (2018).
  10. Martinez, M., Brezun, J. M., Bonnier, L., Xerri, C. A new rating scale for open-field evaluation of behavioral recovery after cervical spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 26 (7), 1043-1053 (2009).
  11. Martinez, M., Brezun, J. M., Zennou-Azogui, Y., Baril, N., Xerri, C. Sensorimotor training promotes functional recovery and somatosensory cortical map reactivation following cervical spinal cord injury. European Journal of Neuroscience. 30 (12), 2356-2367 (2009).
  12. Martinez, M., et al. Differential tactile and motor recovery and cortical map alteration after C4-C5 spinal hemisection. Experimental Neurology. 221 (1), 186-197 (2010).
  13. Leszczynska, A. N., Majczynski, H., Wilczynski, G. M., Slawinska, U., Cabaj, A. M. Thoracic hemisection in rats results in initial recovery followed by a late decrement in locomotor movements, with changes in coordination correlated with serotonergic innervation of the ventral horn. PLoS One. 10 (11), e0143602 (2015).
  14. Ballermann, M., Fouad, K. Spontaneous locomotor recovery in spinal cord injured rats is accompanied by anatomical plasticity of reticulospinal fibers. European Journal of Neuroscience. 23 (8), 1988-1996 (2006).
  15. Garcia-Alias, G., et al. Chondroitinase ABC combined with neurotrophin NT-3 secretion and NR2D expression promotes axonal plasticity and functional recovery in rats with lateral hemisection of the spinal cord. Journal of Neuroscience. 31 (49), 17788-17799 (2011).
  16. Petrosyan, H. A., et al. Neutralization of inhibitory molecule NG2 improves synaptic transmission, retrograde transport, and locomotor function after spinal cord injury in adult rats. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4032-4043 (2013).
  17. Schnell, L., et al. Combined delivery of Nogo-A antibody, neurotrophin-3 and the NMDA-NR2d subunit establishes a functional ‘detour’ in the hemisected spinal cord. The European journal of neuroscience. 34 (8), 1256-1267 (2011).
  18. Shah, P. K., et al. Use of quadrupedal step training to re-engage spinal interneuronal networks and improve locomotor function after spinal cord injury. Brain. 136, 3362-3377 (2013).
  19. Schucht, P., Raineteau, O., Schwab, M. E., Fouad, K. Anatomical correlates of locomotor recovery following dorsal and ventral lesions of the rat spinal cord. Experimental Neurology. 176 (1), 143-153 (2002).
  20. Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
  21. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  22. Barros Filho, T. E. P. d., Molina, A. E. I. S. Analysis of the sensitivity and reproducibility of the Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) scale in Wistar rats. Clinics (Sao Paulo, Brazil). 63 (1), 103-108 (2008).
  23. Inoue, T., et al. Combined SCI and TBI: recovery of forelimb function after unilateral cervical spinal cord injury (SCI) is retarded by contralateral traumatic brain injury (TBI), and ipsilateral TBI balances the effects of SCI on paw placement. Experimental Neurology. 248, 136-147 (2013).
  24. Vichaya, E. G., Baumbauer, K. M., Carcoba, L. M., Grau, J. W., Meagher, M. W. Spinal glia modulate both adaptive and pathological processes. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (7), 969-976 (2009).
  25. Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. -. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), e01324 (2019).
  26. Ham, T. R., et al. Automated gait analysis detects improvements after intracellular sigma peptide administration in a rat hemisection model of spinal cord injury. annals of biomedical engineering. 47 (3), 744-753 (2019).
  27. Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
  28. Neckel, N. D., Dai, H. N., Burns, M. P. A novel multidimensional analysis of rodent gait reveals the compensation strategies employed during spontaneous recovery from spinal cord and traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. , (2018).
  29. Fouad, K., Metz, G. A. S., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E. Treadmill training in incomplete spinal cord injured rats. Behavioural Brain Research. 115 (1), 107-113 (2000).
  30. Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
  31. Alluin, O., et al. Kinematic study of locomotor recovery after spinal cord clip compression injury in rats. Journal of Neurotrauma. 28 (9), 1963-1981 (2011).
  32. Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Effect of locomotor training in completely spinalized cats previously submitted to a spinal hemisection. Journal of Neuroscience. 32 (32), 10961-10970 (2012).
  33. Behrmann, D. L., Bresnahan, J. C., Beattie, M. S., Shah, B. R. Spinal cord injury produced by consistent mechanical displacement of the cord in rats: behavioral and histologic analysis. Journal of Neurotrauma. 9 (3), 197-217 (1992).
  34. Soblosky, J. S., Colgin, L. L., Chorney-Lane, D., Davidson, J. F., Carey, M. E. Ladder beam and camera video recording system for evaluating forelimb and hindlimb deficits after sensorimotor cortex injury in rats. Journal of Neuroscience Methods. 78 (1-2), 75-83 (1997).
  35. Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nature Neuroscience. 7 (3), 269-277 (2004).
  36. Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
  37. van den Brand, R., et al. Restoring voluntary control of locomotion after paralyzing spinal cord injury. Science. 336 (6085), 1182-1185 (2012).
  38. Lukovic, D., et al. Complete rat spinal cord transection as a faithful model of spinal cord injury for translational cell transplantation. Scientific Reports. 5, 9640-9640 (2015).
  39. Wilson, S., et al. The hemisection approach in large animal models of spinal cord injury: overview of methods and applications. Journal of Investigative Surgery. 10, 1-12 (2018).
  40. Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Incomplete spinal cord injury promotes durable functional changes within the spinal locomotor circuitry. Journal of Neurophysiology. 108 (1), 124-134 (2012).
  41. Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Recovery of hindlimb locomotion after incomplete spinal cord injury in the cat involves spontaneous compensatory changes within the spinal locomotor circuitry. Journal of Neurophysiology. 106 (4), 1969-1984 (2011).
  42. Capogrosso, M., et al. A brain–spine interface alleviating gait deficits after spinal cord injury in primates. Nature. 539, 284-288 (2016).

Tags

Spinal Cord HemisectionLocomotor AssessmentRatThoracicLaminectomyLidocaineDura MaterMidlineDissecting KnifeAnterior Spinal Artery

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Brown, A. R., Martinez, M. Thoracic Spinal Cord Hemisection Surgery and Open-Field Locomotor Assessment in the Rat. J. Vis. Exp. (148), e59738, doi:10.3791/59738 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image