Chirurgie de l'hémisection de la moelle épinière thoracique et évaluation locomotrice à champ ouvert chez le rat

Summary

L’hémisection spinale thoracique de rat est un modèle valable et reproductible des dommages unilatéraux de moelle épinière pour étudier les mécanismes neurals de la récupération locomotrice et de l’efficacité de traitement. Cet article comprend un guide détaillé étape par étape pour effectuer la procédure d’hémisection et d’évaluer les performances locomotrices dans une arène de champ ouvert.

Abstract

Les lésions de la moelle épinière (SCI) causent des perturbations dans la fonction motrice, sensorielle et autonome au-dessous du niveau de la lésion. Les modèles animaux expérimentaux sont des outils précieux pour comprendre les mécanismes neuronaux impliqués dans la récupération locomotrice après SCI et pour concevoir des thérapies pour les populations cliniques. Il existe plusieurs modèles expérimentaux de SCI, y compris la contusion, la compression et les blessures par transsection qui sont utilisés dans une grande variété d’espèces. Une hémisection implique la transection unilatérale de la moelle épinière et perturbe toutes les voies ascendantes et descendantes d’un seul côté. L’hémisection spinale produit une blessure fortement sélective et reproductible par rapport aux techniques de contusion ou de compression qui est utile pour étudier la plasticité neurale dans les voies épargnées et endommagées liées à la récupération fonctionnelle. Nous présentons un protocole étape par étape détaillé pour effectuer une hémisection thoracique au niveau vertébral de T8 dans le rat qui a comme conséquence une paralysie initiale du membre postérieur sur le côté de la lésion avec le rétablissement spontané gradué de la fonction locomotrice au-dessus de plusieurs Semaines. Nous fournissons également un protocole de notation locomoteur pour évaluer la récupération fonctionnelle dans le champ ouvert. L’évaluation locomotrice fournit un profil de récupération linéaire et peut être effectuée à la fois tôt et à plusieurs reprises après les blessures afin de filtrer avec précision les animaux pour les points de temps appropriés dans lesquels effectuer des tests comportementaux plus spécialisés. La technique d’hémisection présentée peut être facilement adaptée à d’autres modèles et espèces de transection, et l’évaluation locomotrice peut être utilisée dans une variété de SCI et d’autres modèles de blessures pour marquer la fonction locomotrice.

Introduction

Les dommages de moelle épinière (SCI) sont associés aux perturbations graves dans la fonction motrice, sensorielle, et autonome. Les modèles animaux expérimentaux de SCI sont des outils précieux pour comprendre les événements anatomiques et physiologiques impliqués dans la pathologie de SCI, pour étudier les mécanismes neuronaux dans la réparation et la récupération, et pour dépister l’efficacité et l’innocuité de la thérapeutique potentielle Interventions. Le rat est l’espèce la plus couramment utilisée dans la recherche SCI¹. Les modèles de rat sont peu coûteux, faciles à reproduire, et une grande batterie de tests comportementaux sont disponibles pour évaluer les résultats fonctionnels². Malgré quelques différences dans l’emplacement des voies, la moelle épinière du rat partage des fonctions sensorimotrices similaires globales avec les grands mammifères, y compris les primates^3,4. Les rats partagent également des conséquences physiologiques et comportementales analogues à l’ICS qui se rapportent aux humains⁵. Les primates non humains et les grands modèles animaux peuvent fournir une approximation plus proche de l’homme SCI⁶ et sont essentiels pour prouver l’innocuité et l’efficacité du traitement avant l’expérimentation humaine, mais sont moins couramment utilisés en raison de l’éthique et le bien-être animal considérations, dépenses et exigences réglementaires⁷.

Les modèles de SCI de transection de rat sont exécutés par l’interruption ciblée de la moelle épinière avec une lésion sélective utilisant un couteau de dissection ou des ciseaux d’iridectomy après une laminectomy. Comparé à une transection complète, la transection partielle dans le rat a comme conséquence des dommages moins graves, le soin postopératoire plus facile d’animal, le rétablissement locomoteur spontané, et plus étroitement des modèles SCI chez l’homme qui est principalement incomplet avec l’épargnant partiel de tissu reliant la moelle épinière et les structures supraspinales⁸. Une hémisection unilatérale perturbe toutes les voies ascendantes et descendantes d’un seul côté, et produit des déficits locomoteurs quantifiables et hautement reproductibles, améliorant l’exploration des mécanismes biologiques sous-jacents. La conséquence fonctionnelle la plus importante de l’hémisection est une paralysie initiale de membre du même côté et au-dessous du niveau de la lésion avec le rétablissement spontané gradué de la fonction locomotrice sur plusieurs semaines^{9,10, 11} Ans, états-unis ( ^{, 12}. Le modèle d’hémisection est particulièrement utile pour étudier la plasticité neuronale des voies et circuits endommagés et résiduels liés à la récupération fonctionnelle^{9,11,12, 13,14,15,16,17,18}. Plus précisément, l’hémisection effectuée au niveau thoracique, c’est-à-dire au-dessus des circuits spinaux qui contrôlent la locomotion de l’arrière-pays, est particulièrement utile pour étudier les changements dans le contrôle locomoteur. Comme une relation non linéaire existe entre la sévérité des lésions et la récupération locomotrice après SCI¹⁹, des tests comportementaux appropriés pour évaluer les résultats fonctionnels sont primordiaux dans les modèles expérimentaux.

Une batterie complète de tests comportementaux sont disponibles pour évaluer les aspects spécifiques de la récupération locomotrice fonctionnelle chez le rat^2,20. Beaucoup de tests locomoteurs ne fournissent pas de mesures fiables tôt après SCI que les rats sont trop handicapés pour soutenir leur poids corporel. Une mesure de la performance locomotrice spontanée qui est sensible aux déficits tôt après une blessure, et ne nécessite pas de formation préopératoire ou d’équipement spécialisé, est bénéfique afin de surveiller la récupération locomotrice pour les points de temps appropriés dans lesquels compléter les tests comportementaux spécialisés. Le score d’évaluation en champ ouvert¹⁰de Martinez, initialement développé pour évaluer la performance locomotrice après l’IC cervicale chez le rat, est un score ordinal de 20 points évaluant la performance locomotrice globale pendant la locomotion spontanée au-dessus du sol dans un champ ouvert. La notation est effectuée séparément pour chaque membre à l’aide d’une rubrique qui évalue les paramètres spécifiques d’une gamme de mesures locomotrices, y compris le mouvement des membres articulaires, le soutien du poids, la position des chiffres, les capacités de pas, la coordination avant-membre et le membre postérieur, et la queue position. Le score d’évaluation est dérivé de l’échelle d’évaluation en champ ouvert de Basso, Beattie et Bresnahan (BBB) conçue pour évaluer les performances locomotrices après contusion thoracique²¹. Il est adapté pour évaluer avec précision et fiabilité à la fois la fonction locomotrice des membres antérieurs et des membres postérieurs, permet une évaluation indépendante des différents paramètres de notation qui ne sont pas adaptés à la notation hiérarchique du BBB, et fournit une récupération linéaire profil¹⁰. En outre, par rapport à la BBB, le score d’évaluation est sensible et fiable dans les modèles de blessures plus graves^10,11,20,22. Le score d’évaluation a été utilisé pour évaluer l’affaiblissement locomoteur chez le rat suivant cervical^10,12 et thoracique⁹ SCI seul et en combinaison avec des lésions cérébrales traumatiques²³.

Nous présentons ici un protocole détaillé étape par étape pour effectuer une sCI d’hémisection thoracique au niveau vertébral de T8 dans le rat long-Evans femelle, et pour évaluer la récupération locomotrice de membre arrière dans le champ ouvert.

Protocol

Les expériences décrites dans cet article ont été réalisées conformément aux lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux et ont été approuvées par le comité d’éthique de l’Université de Montréal. 1. Chirurgie de l’hémisection thoracique Portez l’équipement de protection approprié (gants, masque et robe) pour maintenir un environnement aseptique pour la chirurgie. Nettoyez la zone chirurgicale avec des lingettes d’alcool, et placez des rideaux chi…

Representative Results

Des lésions reproductibles avec un degré élevé de cohérence peuvent être générées avec la technique d’hémisection. Pour évaluer et comparer des tailles de lésions entre les groupes expérimentaux, la zone maximale de la lésion en pourcentage de la section transversale totale de la moelle épinière peut être facilement calculée avec la coloration histologique des sections de moelle épinière. La figure 1 montre une lésion représentative de l’hémicorde gauche et une couche …

Discussion

Une force majeure de la technique d’hémisection est la sélectivité et la reproductibilité de la lésion qui conduit à une variabilité réduite dans les phénotypes histologiques et comportementaux entre les animaux²⁵. Afin d’assurer une lésion unilatérale au niveau spinal approprié, l’identification précise du segment vertébral approprié et de la ligne médiane de moelle épinière est critique. Comme il peut y avoir une tendance pour la moelle épinière à tourner dans la direction d…

Materials

Baytril	CDMV	11242
Blunt dissection scissors	World Precision Instruments	503669
Buprenorphine hydrochoride	CDMV
Camera lens	Pentax	C31204TH	12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount
CMOS video camera	Basler	acA2000-165uc	2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3
Compressed oxygen gas	Praxair
Cotton tipped applicators	CDMV	108703
Delicate bone trimmers	Fine Science Tools	16109-14
Dissecting knife	Fine Science Tools	10055-12
Dumont fine forceps (#5)	Fine Science Tools	11254-20
Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2  suture (J392H)	CDMV	111689
Feedback-controlled heating pad	Harvard Apparatus	55-7020
Female Long-Evans rats	Charles River Laboratories	Strain code: 006	225-250g
Gelfoam	CDMV	102348
Curved hemostat forceps	Fine Science Tools	13003-10
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Hydrogel	70-01-5022	Clear H20
Isofluorane	CDMV	118740
Lactated Ringer's solution	CDMV	116373
Lidocaine (2%)	CDMV	123684
Needle 30 ga	CDMV	4799
Open-field area	Custom		Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height
Opthalmic ointment	CDMV	110704
Personal computer			With USB3 connectivity to record video with the listed camera
Physiological saline	CDMV	1399
Proviodine	CDMV	4568
Rodent Liquid Diet	Bioserv	F1268
Scalpal blade #11	CDMV	6671
Self-retaining retractor	World Precision Instruments	14240
Vannas iridectomy spring scissors	Fine Science Tools	15002-08
Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer	Dispomed	975-0510-000
VLC media player	VideoLAN		videolan.org/vlc